张承昊，金 瑛，范青洪，孙鹏鹏，吴术红，刘 毅

    (遵义医学院附属医院 骨一科，贵州 遵义 563099)

    基础医学研究

    rBMSC和rLFs做为韧带组织工程种子细胞的特性比较

    张承昊，金 瑛，范青洪，孙鹏鹏，吴术红，刘 毅

    (遵义医学院附属医院 骨一科，贵州 遵义 563099)

    目的 比较大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)和韧带成纤维细胞(rLFs)做为韧带组织工程种子细胞来源的价值。方法 采用密度梯度离心结合贴壁培养法获得rBMSCs，通过组织消化法获取培养rLFs。分别取第3代rBMSCs和rLFs，根据是否添加TGF-β1和bFGF-1生长因子诱导分为诱导组和非诱导组(共4组)。用MTT法检测细胞增殖情况，天狼猩红和固绿检测细胞总胶原蛋白量和总非胶原蛋白量，ELISA法检测细胞内外Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白浓度，实时荧光定量PCR检测细胞韧带特异性基因Tnc、Fn1、Mmp2的mRNA表达水平。结果 rBMSCs原代时的活性和增殖能力高于rLFs，第3代rBMSCs未诱导组的细胞活性明显高于rLFs未诱导组(P1 材料与方法

    1.1 实验动物、主要试剂及仪器 清洁级SD大鼠，雌雄不拘，体重180～220 g,由第三军医大学实验动物中心提供。主要实验材料：Percoll分离液(Pharmacia公司)，胶原酶(上海铭睿生物科技有限公司)，rTGF-β1(Prime Gene Bio-tech Company)，rbFGF-1(Prime Gene Bio-tech Company),天狼猩红和固绿(宝信生物科技有限公司)，ELISA Collagen type Ⅰ、Ⅲ试剂盒(均为上海铭睿生物科技有限公司产品)，RNAisoPlus、逆转录试剂盒和SYBR?Premix Ex TaqtTM(均为大连TaKaRa公司产品)。主要实验仪器：流式细胞仪(FACS Calibur,Becton Dickinson,USA)，逆转录仪(德国Eppendorf公司)，核酸蛋白测量ND-1000(美国Nanodrop公司)，实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

    1.2 大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)分离和培养 脱颈法处死大鼠，在无菌条件下取双侧股骨及胫骨，去除软组织和肌肉，含双抗的PBS溶液冲洗后再用含双抗的DMEM培养液漂洗。咬骨钳咬除干骺端，LG-DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，2000 rpm离心5 min，弃上清。加入LG-DMEM培养液吹打制成细胞悬液 ......