技术与方法

    基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7方法的建立

    赵娟娟1,2，徐华林1,2，陶弋婧1,2，郭萌萌1,2，周涯3，陈超1,2，秦娜琳1,2，郑静1,2，田丹1,2，徐林1,2

    (1. 遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地，贵州 遵义563099；2.贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义563099；3. 遵义医学院 医学物理学教研室，贵州 遵义563099)

    [摘要]目的 本研究旨在利用常规荧光燃料SYBR GreenⅠ，通过茎-环法设计原理，建立有效检测微小RNA-7(miR-7)的Real-time PCR方法。方法 利用miRBase数据库获得miR-7的成熟体序列，分别设计1条miR-7特异性反转录引物，以及Real-time PCR上游和下游引物；观察不同退火温度和不同引物浓度对扩增miR-7的Ct值影响，选择最优的退火温度和引物浓度；测定不同稀释度RNA下Real-time PCR扩增 miR-7的效果；并利用该方法检测小鼠4个器官中miR-7的灵敏性和特异性。结果 在基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR检测法中，miR-7扩增的最优退火温度为60 ℃，最优引物浓度为10 μmol/L；在不同稀释度RNA下miR-7的Ct值线性关系较好，且在模板RNA低于100 pg的条件下，该方法仍可有效检测miR-7分子；最后有效检测出小鼠4个不同器官中miR-7的差异性表达。结论 成功建立基于SYBR GreenⅠ的茎-环Real-time PCR定量检测miRNA-7的方法，可为后续研究miR-7的生物学功能提供了重要工作基础。

    [关键词]茎-环Real-time PCR法；SYBR GreenⅠ；微小RNA-7；表达

    微小RNAs(miRNA)是一类内源性长18~25个核苷酸的单链非编码RNA分子，主要通过结合靶基因的3’非翻译区抑制靶基因的翻译或诱导靶基因降解，从而调控真核基因的表达。大量研究显示特定miRNAs分子参与多种临床疾病的发生过程，特定miRNAs表达水平的变化与包括肿瘤、自身免疫性疾病等临床疾病的预后密切相关，因此，其表达水平的检测也逐渐发展为相关临床疾病诊断的重要辅助手段。

    微小RNA-7(miR-7)作为miRNA家族成员之一，已有研究显示其不仅在多个机体组织、器官及细胞中存在表达[1-2]，且在组织器官的发育、分化及病理损伤过程中发挥重要作用[3-5] ......