徐华林，赵娟娟，褚风云，郭萌萌，何志旭，陈 超，徐 林

    (1.遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地，贵州 遵义 563099；2. 遵义医学院 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义 563099；3. 贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵州 贵阳 550004)

    基础医学研究

    微小RNA-7慢病毒过表达载体的构建及其作用

    徐华林1,2，赵娟娟1，褚风云1，郭萌萌1，何志旭3，陈 超1，徐 林1,2

    (1.遵义医学院 免疫学教研室暨贵州省生物治疗人才基地，贵州 遵义 563099；2. 遵义医学院 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义 563099；3. 贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵州 贵阳 550004)

    目的 构建miR-7慢病毒过表达载体，并对人肺癌细胞进行感染，观察其影响效果。方法 设计引物，PCR法扩增miR-7初级序列；纯化、经BamHI和EcoRI双酶切后将其亚克隆入pLVX-shRNA慢病毒表达载体，并进行酶切及测序鉴定；将构建成功的pLVX-shRNA-miR-7(命名为pLV-miR-7)载体体外转染293T细胞进行包装，在48 h收获上清，用Real-timePCR法测定该慢病毒滴度；将制备好的病毒上清体外感染人肺癌95 D细胞后，用Real-time PCR检测各组中miR-7成熟体表达水平；CCK-8法检测95 D细胞生长变化。结果 菌液PCR和酶切结果显示miR-7目的片段418 bp成功构入载体pLVX-shRNA；同时结合测序结果证明构建miR-7慢病毒过表达载体成功；慢病毒上清滴度为1.53×107copies/mL；该病毒感染人肺癌95 D细胞后可有效表达miR-7成熟体，并显著抑制细胞的体外生长(P1 材料与方法

    1.1 材料 人肺癌细胞株95 D细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。限制性内切酶BamHI与EcoRI、T4DNA 连接酶(Thermo公司)；SYBR Premix Ex real-time PCR试剂盒(TAKARA公司)；DH5α感受态细胞由本实验室保存；质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)；PRIME1640 培养基(Gibco公司)；优质胎牛血清(BI公司)；pLvx-shRNA慢病毒表达载体、Lenti-XTMqRT-PCR Titration试剂盒(Clontech公司)；分析纯级异丙醇、无水乙醇(重庆川东化工公司)；CCK-8试剂(博士德公司) ......