李 科，魏义勇，刘 云，曹 嵩，刘兴奎，王海英，喻 田

    (1. 遵义医学院附属口腔医院 麻醉科，贵州 遵义 563099； 2. 遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义 563099；3. 遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

    技术与方法

    Nycodenz密度梯度离心法提取及纯化大鼠心肌线粒体

    李 科1，魏义勇2，刘 云3，曹 嵩2，刘兴奎2，王海英2，喻 田2

    (1. 遵义医学院附属口腔医院 麻醉科，贵州 遵义 563099； 2. 遵义医学院附属医院 麻醉科，贵州 遵义 563099；3. 遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

    目的 建立一种利用Nycodenz密度梯度离心法提取组织线粒体的方法。方法 传统离心方法得到粗提线粒体后，在Nycodenz密度梯度介质中超高速离心得到纯化线粒体，进一步在经改良的线粒体分离介质中重复离心2次，得到高纯度的线粒体。利用透射电镜和Western Blot检测线粒体纯度。结果 使用Nycodenz密度梯度离心法和线粒体分离介质提纯的线粒体量多、纯度较高(COX Ⅳ含量纯化组：粗提组=220%±26%vs.160%±34%，P1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠，重250～300 g，4～5月龄(由第三军医大学提供)。

    1.1.2 主要试剂 K-H液，成分(单位mmol/L)：NaCl 118.00、NaHCO324.80、KCl 4.75、CaCl22.50、MgCl2·6H2O 1.19、KH2PO41.19、葡萄糖11.1、线粒体分离介质(210 mmol/L mannitol、5 mmol/L Tris-HCl、70 mmol/L sucrose、1 mmol/L EDTA，pH =7.4)、Nycodenz密度梯度介质(20%～34%，溶于线粒体分离介质)、裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、5 mmol/L EGTA、4% CHAPS、65 mmol/L DTT，pH =7.4)等[11]。以上试剂购自Sigma公司或Amresco公司。BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天公司。

    1.1.3 主要仪器 垂直凝胶电泳仪(Bio-Rad，美国)、高速离心机(Thermo Fisher，美国)、超速离心机(Beckman，美国)、透射电镜(HITACHI，日本)、Odyssey红外荧光成像系统(Licor，美国) ......