李晓倩，曹广如，王英全，王 苗，敖 骏，蔡玉强，岳昌武,3

    (1.遵义医学院 贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 脊柱外科，贵州 遵义 563099; 3.遵义医学院第三附属医院 中心实验室，贵州 遵义 563002)

    基础医学研究

    抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗的构建与表达

    李晓倩1，曹广如2，王英全1，王 苗1，敖 骏2，蔡玉强2，岳昌武1,3

    (1.遵义医学院 贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 脊柱外科，贵州 遵义 563099; 3.遵义医学院第三附属医院 中心实验室，贵州 遵义 563002)

    目的 构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗。方法 利用DNA重组技术，将激活细胞免疫和体液免疫的MPT64/Ag85B优势抗原基因和野生型katG基因编码区以及穿孔素/颗粒溶素整合进串联真核表达载体pIRES2-EGFP中，构建抗结核重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1；电转化方法将质粒重组耻垢分枝杆菌制备菌苗；通过脂质体Lipofectamine 2000介导将重组质粒转染293T细胞。应用qRT-PCR 技术在mRNA水平检测靶基因体外表达效果并用Western blot方法检测转染细胞是否表达目的蛋白。结果 PCR证实重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1构建成功并制备重组耻垢分枝杆菌菌苗；qRT-PCR分析表明重组质粒的靶基因MPT64/Ag85B、katG、GNLY/PRF1基因转染293T细胞后均有表达，免疫印迹分析重组质粒的融合蛋白MPT64/Ag85B在相对分子质量72 kDa处有明显蛋白表达条带，且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达；融合蛋白GNLY/PRF在相对分子质量75 kDa处有明显蛋白表达条带。结论 成功构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗，为进一步研究该疫苗的免疫作用提供依据。

    耻垢分枝杆菌；疫苗；耐药结核分枝杆菌；多价疫苗；表达分析

    结核病 (tuberculosis,TB)由结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB) 引起的慢性传染病，是目前危害人类健康的主要疾病[1]。WHO估计全世界已有约20亿人感染结核病，其中受耐药菌株感染者可能达到5 000万 ......