文 强，唐明美，陈 玲，彭章丽，何月娟，唐正洪

    (1.遵义医学院附属医院 呼吸二科,贵州 遵义 563099；2.山东省临沂市人民医院东医疗区 内三科，山东 临沂 276000)

    临床医学研究

    结核分枝杆菌包涵体蛋白Rv3480c的克隆、表达与纯化

    文 强1，2，唐明美1，陈 玲1，彭章丽1，何月娟1，唐正洪1

    (1.遵义医学院附属医院 呼吸二科,贵州 遵义 563099；2.山东省临沂市人民医院东医疗区 内三科，山东 临沂 276000)

    目的应用分子生物学技术对结核分枝杆菌重组抗原Rv3480c基因进行克隆、表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，克隆Rv3480c基因片段，产物经验证后与载体质粒pET28a连接重组质粒，将验证构建成功的重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21(DE3)菌体内，经异丙基半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达，溶解包涵体，并通过多次低温冻融、不同浓度尿素复性方法进行包涵体蛋白质的纯化。结果扩增后基因电泳试验及测序证实成功重组目的基因，用尿素溶液和磷酸盐缓冲液(PBS)透析和纯化重组蛋白，Western-Blot证实成功重组结核分枝杆菌抗原Rv3480c。结论应用分子生物学技术成功获得结核分枝杆菌Rv3480c蛋白，为其结构和功能的进一步研究奠定了基础，并为包涵体蛋白的纯化提供了新的技术思路。

    结核分枝杆菌；Rv3480c；包涵体；克隆；纯化

    结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,是全球范围内单一病原体引起人类死亡人数最多的疾病之一[1]。2015年，全球估计有1040万新发结核病患者，结核病已成为导致20～59岁女性死亡的五大重要原因之一，也是威胁儿童健康的重要疾病，结核病更是HIV阳性感染者死亡的主要杀手，中国是全球结核病患者比例居前六位的国家之一[2]。

    面对如此严峻的结核病疫情，快速诊断和早期治疗是控制结核病疫情的重要手段[3]。卡介菌纯蛋白衍化物(PPD)皮试、结核菌涂片/培养检查、γ干扰素释放试验/TSPOT-TB等技术方法是目前结核病实验室诊断的重要手段。在这些常用的诊断方法中，PPD敏感性较高但特异性差，细菌学检查是诊断结核病的金标准，但抗酸杆菌涂片阳性率低，而传统结核分枝杆菌培养周期长，延误结核病早期诊治，γ干扰素释放试验/TSPOT-TB敏感性和特异性均高，但不能区分活动性结核病和潜伏性结核感染，且价格昂贵[4]。同时，传统的实验室诊断技术不能满足肺外结核病的临床应用[5] ......