胡晓芳，刘茂生，卢 巍，李建平，罗江福，陈 跃

    (1.遵义医学院 珠海校区人体解剖与组织胚胎学教研室，广东 珠海 519041；2.遵义医学院 珠海校区临床医学系2016级，广东 珠海 519041)

    基础医学研究

    TAT-DV3-Bcl-2 siRNA促进U251胶质瘤细胞凋亡的研究

    胡晓芳1，刘茂生1，卢 巍1，李建平1，罗江福2，陈 跃2

    (1.遵义医学院 珠海校区人体解剖与组织胚胎学教研室，广东 珠海 519041；2.遵义医学院 珠海校区临床医学系2016级，广东 珠海 519041)

    目的设计合成肿瘤靶向穿膜肽TAT-DV3，联合Bcl-2 siRNA，体外实验研究其对U251胶质瘤细胞的作用。方法设计合成特异性Bcl-2 siRNA及靶向肽TAT-DV3，利用静电作用使两者结合。体外培养U251胶质瘤细胞，TAT-DV3-Bcl-2 siRNA复合物处理细胞后，激光共聚焦显微镜追踪Bcl-2 siRNA进入细胞的分布。PCR检测靶基因Bcl-2沉默情况，Western blot检测Bcl-2蛋白表达；Annexin-V FITC与PI联合标记细胞后，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果激光共聚焦显微镜结果证明TAT-DV3-Bcl-2 siRNA成功进入U251细胞内。PCR及Western blot验证了TAT-DV3-Bcl-2 siRNA沉默了目标基因Bcl-2。利用流式细胞仪进行凋亡检测，发现与对照组相比TAT-DV3-Bcl-2 siRNA可以显著促进U251细胞凋亡。结论靶向肽TAT-DV3可有效投递Bcl-2 siRNA进入U251胶质瘤细胞，通过降解Bcl-2 mRNA抑制Bcl-2的表达并促进胶质瘤细胞的凋亡。

    脑胶质瘤；siRNA；靶向肽；Bcl-2；U251

    RNA干扰技术(RNAi)作为一种新的治疗方法攻克肿瘤为当前研究热点[1]，siRNA可有效沉默特定基因，但其本身的结构和性质阻碍了基于siRNA的治疗方法的发展，比如分子量大，且自身带负电荷等，普通脂质体转染效率较低[2-3]。TAT是第一个发现的穿膜肽，有较强的穿膜作用，DV3是趋化因子受体-4(CXCR4)的结合区域,可与肿瘤特异性结合[4]，以TAT-DV3作为siRNA投递系统来抑制肿瘤生长尚未见文献报道，本课题将二者结合，作为靶向投递Bcl-2 siRNA进入胶质瘤细胞的载体，使siRNA发挥抑制胶质瘤生长的作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料与仪器 U251胶质瘤细胞株购自美国ATCC公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibico公司)；0.25%胰蛋白酶、PBS(凯基生物公司)；PCR扩增目的基因Bcl-2及内参GAPDH引物(上海生工生物工程有限公司)；Bcl-2 siRNA(美国Invitrogen公司)；RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒及qPCR试剂盒(日本Takara公司)；Bcl-2一抗、GAPDH一抗及兔抗IgG(英国Abcam公司)；Annexin-V凋亡试剂盒(凯基生物公司)；CO2恒温培养箱(德国Heraeus公司)；荧光定量PCR仪(德国Biometra公司)；激光共聚焦扫描显微镜(日本Olympus公司) ......