周艳萌，向晓波，王 欢

    (1.遵义医科大学 基础医学院微生物学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学附属口腔医院，贵州 遵义 563099)

    乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)仍然是世界大多数地区肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的主要病因，中国的肝细胞癌发病率居世界前列[1]。有丝分裂检查点基因BUBR1(Mitotic checkpoint serine/Threonine kinase B)与酵母细胞Mad3同属一个家族基因，其编码的BUBR1蛋白是有丝分裂纺锤体组装检查点(Spindle assembly checkpoint，SAC)基因中的重要组分，在染色体分离、招募有丝分裂检查点复合体成员和激活纺锤体检查点等方面发挥着重要作用[2]。有研究发现，在约45%的HCC中BUBR1呈高表达；在BUBR1表达增高者中，大多数人的血清HBsAg呈阳性，BUBR1基因可能在肝癌的发生、发展、侵袭或复发中起重要作用[3-4]。Kim等[5]的研究指出：BUBR1是有丝分裂检查点复合体(Mitotic checkpoint complex，MCC)的关键成分，是HBx病毒癌蛋白的靶点。HBx-BUBR1相互作用破坏了MCC中CDC20的结合，表达HBx的细胞经历了错误的有丝分裂过程。近年来，有研究发现HepG2.2.15细胞对5-FU、ADM、Amn等化疗药物的敏感性明显低于HepG2细胞，提示HBV感染与肝癌细胞对化疗药物耐药的发展可能有一定关系[6-7]。本研究利用慢病毒载体和RNAi干扰技术构建慢病毒介导的BUBR1沉默载体，沉默稳定转染了HBV全基因组的肝癌细胞HepG2.2.15的BUBR1基因，并筛选出稳定沉默BUBR1基因的细胞株，为研究HBV所致肝细胞癌化疗耐药与BUBR1基因的关系提供一种新的实验手段。

    1 材料与方法

    1.1 材料 HepG2.2.15细胞株由遵义医科大学微生物学与免疫学实验室提供。293T细胞、大肠杆菌菌株DH5α、慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G、表达质粒phU6-CMV-GFP-puro (含氨苄霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因)shRNA载体购自上海吉凯基因公司。DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清购自Hyclone公司。转染试剂Lipofectamine2000和嘌呤霉素购于美国Invitrogen公司 ......