杜文胜，朱杰华，王 娟，邓凤琳 ，黄俊琼，鄢仁晴

    (1.遵义医科大学附属医院 医学检验科，贵州 遵义 563099；2.遵义市第一人民医院 神经内科二病区，贵州 遵义 563000；3.遵义医科大学附属医院 输血科，贵州 遵义 563099)

    结核病(Tuberculosis，TB)是严重的传染性疾病，从发现至今有一百多年的历史，却仍然没能消灭的原因是宿主与结核杆菌相互作用的机制不明确。导致结核病的病原体是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，结核分枝杆菌不同于一般细菌，虽无内外毒素和侵袭性酶，但其结构组分复杂，不同免疫细胞对结核杆菌的不同成分又有不同应答效应，故机体抗结核感染机制复杂，至今未明。外泌体(Exosomes，Exos)作为细胞内源性的小囊泡结构，介导体内不同细胞间的通讯，影响机体正常和病理状态，被证实与多种疾病相关，是最近研究热点[1-2]。目前外泌体与结核病关系的研究主要集中在外泌体特征、对细胞功能影响以及是否可以作为结核病诊断与鉴别诊断的潜在生物学标志方面，而关于外泌体与结核性胸膜炎关系方面研究较少。本研究通过分离纯化Exos后提取总RNA，再通过高通量测序分析其内差异表达miRNAs，并生物信息学分析其主要功能及可能的信号通路。

    1 材料与方法

    1.1 标本收集 收集来自遵义医科大学附属医院呼吸二科结核病专科的12例肺结核合并结核性胸膜炎患者(试验组)的血清和胸水标本，患者符合临床结核病的诊断标准[3]，排除患有免疫抑制性疾病如艾滋病、糖尿病或自身免疫性疾病及应用免疫抑制剂。12 例健康体检者(对照组)血清标本。标本采集后即刻提取Exos，-80℃冰箱保存备用，留取小部分进行鉴定。本研究通过遵义医科大学附属医院伦理委员审查。

    1.2 血清Exos提取与鉴定及miRNA 高通量测序

    1.2.1 血清Exos提取 血清及胸水中Exos体提取采用辽宁润基生物科技有限公司生产的外泌体提取和纯化试剂盒，基本原理是试剂盒吸附柱上有一种根据外泌体膜结构分子特点而设计和修饰的树脂成分，这种树脂成分仅能与外泌体脂质双分子层成分结合，而不与样本中其它蛋白质结合实现外泌体的提取和纯化，从而得到较纯的完整外泌体(这种方法能够简单、快速地捕获生物样本中外泌体，又易于操作，适合常规外泌体实验要求，有广泛的下游应用)。血清及胸水中Exos提取的具体方法：(1)样本预处理：新鲜收集的血清和胸水样本置于冰上平衡，12 000×g，4℃离心15 min，去除细胞或细胞碎片 ......