车益军,韩 冲,于欣宇,刘 潜,王丽芳,张 鹏,曹 芳,姚声涛

    (1.遵义医科大学附属医院 神经外科二病区,贵州 遵义 563099;2.遵义市播州区人民医院 神经外科,贵州 遵义563100;3.遵义医科大学附属第二医院 神经外科,贵州 遵义 563006)

    自发性脑出血(intracranial hemorrhage,ICH)是一种严重致死致残性疾病,目前尚无明确有效治疗脑出血的药物[1],亟需探索治疗药物及治疗靶点。脑出血后细胞死亡机制包括血肿的直接压迫破坏作用和继发性损伤,其中焦亡被认为最具潜力的继发性损伤机制治疗靶点[2]。星形胶质细胞是颅内最多数的神经细胞,具有广泛的生物学意义[3]。脑出血后星形胶质细胞发生细胞焦亡,GSDMD在 ICH 后细胞焦亡中起着最关键的作用[4]。NLRP3/Cappase-1/GSDMD为焦亡最经典通路[5]。ICH后星形细胞中NLRP3炎症通路被激活[6]。脑出血后星形胶质细胞中NF-κB P65信号通路激活,IL-1β炎症激活[7]。本课题组前期研究结果证实抑制NLRP3表达可以减轻小鼠脑出血并减少C-Cas-1表达及小胶质细胞炎症反应[8]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶(silent information regalator 1,SIRT 1)通过对靶蛋白去乙酰化发挥作用,其可通过对p65去乙酰化调控细胞炎症[9]。王毅团队对中药195 种不同化合物进行筛选,发现五味子甲素(schisandrin A,SchA)是SIRT1最强激活剂之一[10],具有减轻细胞焦亡作用[11]。SchA能否通过调控SIRT1蛋白表达在脑出血后发挥神经保护作用尚未见报道,本研究拟通过五味子甲素治疗脑出血,探讨SIRT1、NF-κB在脑出血后发挥神经保护及减轻星形胶质细胞焦亡机制。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂与仪器 SchA、EX527购自美国MCE公司;TritonX-100、抗荧光衰减封片剂、RIPA高效裂解液、BCA 定量试剂盒、5×上样缓冲液、牛血清白蛋白BSA-Ⅴ、蛋白酶抑制剂均购自北京Solarbio公司;4 %多聚甲醛、购自安徽Biosharp公司;胎牛血清、DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司;胶原酶Ⅶ购自美国Sigma公司;Omni-ECL 超灵敏化学发光检测试剂盒购买自上海雅酶公司;山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗、Anti-GFAP抗体均购买自杭州华安公司;Anti-NLRP3 抗体、Anti-SIRT1 抗体、Anti-GSDMD抗体均购买自英国Abcam公司;乙酰化(k310)NF-κBp65多克隆抗体、NF-κBp65单克隆抗体购自美国Immunoway公司;Cleaved Caspase-1(asp297)抗体购自美国CST公司;488山羊抗小鼠荧光二抗、488山羊抗兔荧光二抗、594山羊抗小鼠荧光二抗、594山羊抗兔荧光二抗均购自武汉Proteintech公司;胰酶购自美国Hyclone公司;CCK8试剂盒购自美国Abbkine公司;OCT包埋剂购买自美国Sakura公司;二氧化碳培养箱、低速自动离心机、酶标仪、生物安全柜购自美国Thermo公司;高速低温离心机购自中国iCEN-24 R公司;倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司;凝胶成像仪、蛋白电泳仪购自美国BIO-RAD公司;恒温水浴箱购自秋佐仪器公司;冰冻切片机购自德国Leica公司;脑立体定位仪购自深圳瑞沃德公司 ......