蔡丽莎,邢 源,黄 佩,陈 艳 ,徐晓军

    (1.遵义医科大学附属医院 小儿内科,贵州 遵义 563099;2.浙江大学医学院附属儿童医院 血液肿瘤内科,浙江 杭州 310003;3.贵州省儿童医院 小儿内科,贵州 遵义 563099;4.遵义医科大学 组织损伤修复与再生医学省部共建协同创新中心,贵州 遵义 563099)

    噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH)是一种由于机体内单核巨噬细胞以及淋巴细胞过度激活,从而产生大量炎症因子的高炎症反应疾病[1-2],死亡率高,成人及儿童均可见[3]。家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis, FHL) 是由参与颗粒依赖性胞吐作用途径的基因突变引起的,其相关基因突变会导致自然杀伤(nature kill, NK)细胞和T淋巴细胞的细胞毒活性受损[4]。现已发现有10余种基因的突变与 HLH 的发病明确相关,如PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、RARB27A、LYST、AP3B1、SH2D1A和BIRC4 等[5]。FHL是一种常染色体隐性遗传病,这意味着只有纯合子或复合杂合子变异才具有致病可能性,而杂合子携带者则不表现出临床症状。然而,一些报道已经介绍了有症状的杂合变异携带者[6],并且随着全基因组测序的开展,越来越多的单等位基因杂合突变在HLH患者中被发现[7],但是其具体位点突变所造成的功能影响却鲜有报道。编码Munc13-4蛋白的基因UNC13D突变会引起家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症3型(FHL3)[8],FHL3几乎占FHL发病的30%～40%[9]。CRISPR/Cas9基因编辑系统,由于其高效率和高精度,在血液病、肿瘤和其他遗传疾病领域都展现出极大的应用前景[10]。本研究通过CRISPR/Cas9 技术敲除人原代T淋巴细胞中的UNC13D基因,经抗生素筛选并扩增出Munc13-4 蛋白极低表达的T淋巴细胞进行体外扩增,再将前期已包装好的野生型以及突变型UNC13D(c.1232 G>A, p.R411Q)慢病毒感染knockout-UNC13D的人T淋巴细胞中,建立基于CRISPR/Cas9基因编辑重建技术检测HLH相关基因UNC13D单等位基因突变的致病性验证方法,以此来判断该UNC13D基因突变位点是否具有致病性。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂及仪器 人胚肾293T细胞株(美国ATCC);质粒Lenti CRISPR V2(美国Addgene公司);野生型和突变型(c.1232 G>A, p.R411Q)pGV348-UNC13D慢病毒(保存于本实验室中);IMDM、RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);X-VIVO培养基(德国LONZA公司);人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司);CD3/CD28磁珠(德国Miltenyi公司);人IL-2(美国PeproTech公司);限制性内切酶BsmBI酶、T7核酸内切酶和T4连接酶(美国NEB公司);感受态Stbl3(上海昂羽生物技术公司);促转剂Polybrene、高保真酶、脂质体转染试剂(上海YEASEN公司);病毒滴度检测试剂(日本 TAKARA 公司);转染级质粒提抽试剂盒(德国QIAGEN公司);基因组抽提试剂盒(北京天根生物公司);DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物公司);鼠抗人CD3-BV421、CD107a-PE、CD8-PE-Cy7抗体(美国Biolegend公司);兔抗人FLAG-PE抗体、一抗兔抗人Munc13-4抗体(英国Abcam公司);二抗PE标记的驴抗兔抗体(美国invitrogen公司) ......