姚金玲,李廷兵,胡 静,万小榆,孔德营

    (遵义医科大学 基础医学院生理学教研室,贵州 遵义 563099)

    氰戊菊酯(fenvalerate,Fen)属Ⅱ型拟除虫菊酯类农药杀虫剂,可干扰男性的睾酮(testosterone,T)合成,进而阻碍精子发生,导致生殖损伤[1-2]。雄性哺乳动物体内的睾酮合成是在下丘脑-腺垂体-睾丸轴的调控下由睾丸间质细胞经过一系列酶促反应完成的。下丘脑合成的促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)作用于腺垂体使之释放促黄体生成素(luteinizing hormone,LH),LH作用于睾丸间质细胞的LH受体,活化胞内的腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,ACs),催化ATP使之转化为cAMP,激活cAMP/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路,调控睾酮合成所需的多种蛋白和酶的表达[3]。在这一过程中,ATP是必不可少的上游信号分子。ATP主要产生于线粒体呼吸链的氧化磷酸化,所以,正常的线粒体功能是睾丸间质细胞中睾酮合成的重要保障。

    研究表明,睾丸组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)激增是杀虫剂等外源性毒物导致睾酮合成障碍的重要诱因[1, 4-6]。线粒体膜通透性转运孔(mitochondrial membrane permeability transport pore, mPTP)是ROS的作用靶点。ROS通过诱导mPTP持续开放,引起线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)下降,从而引发线粒体损伤,但具体分子机制尚不清楚[7-8]。本课题组前期研究结果显示,ROS诱导TM3细胞mPTP开放是在胞浆Ca2+的协同作用下完成的[9]。也有研究认为,ROS诱导mPTP开放的过程中,胞浆Ca2+稳态失衡是必不可少的中间状态与介导因素[10-11],但Ca2+调控mPTP开放的具体分子机制目前鲜有报道。胞内Ca2+的信号调控主要依赖Ca2+/钙调蛋白(calmodulin,CaM)/钙调蛋白激酶(calmodulin kinases,CaMKs)系统[12],但是该信号系统是否在胞内Ca2+稳态失衡后的mPTP开放过程中发挥作用还有待明确。因此,本研究拟通过急性离体染毒实验分析探明Ca2+/CaM/CaMKⅡ信号系统在Fen诱发TM3细胞线粒体损伤进而导致睾酮合成障碍中的作用和机制。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂与仪器 DMEM-F12培养基(BasalMedia,中国);胎牛血清、青链霉素、胰蛋白酶(Hyclone,美国);CaM阻断剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)和氰戊菊酯(Sigma-Aldrich,美国);BAPTA-AM胞内Ca2+离子螯合剂(med chem express,中国);钙荧光探针Flou-4/AM(thermo fisher scientific,美国);线粒体膜电位检测试剂盒JC-1(Yeasen,中国);小鼠睾酮ELISA和小鼠环磷酸腺苷(cAMP)ELISA试剂盒(Meimian,中国);ATP含量检测试剂盒(Aifang,中国);CCK-8试剂盒(索莱宝,中国);GAPDH、CYP11A1、StAR、CaM、Bcl-2、Bax、CaMKⅡγ和CaM抗体(Proteintech,中国);3β-HSD抗体(SANTA,美国);p-CaMKⅡ抗体(Affinity,中国);COXIV(亚科因生物公司,中国);激光共聚焦显微镜(Airyscan,美国);二氧化碳恒温培养箱(Thermo Fisher Scientific,美国);凝胶成像仪(Syngene,美国);PAC1000电泳仪、电转仪、酶标仪(Bid-Rad,美国) ......