支气管哮喘(bronchial asthma)简称哮喘,是一种以慢性气道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的异质性疾病[1]。其中,气道重塑是哮喘最主要的病理特征之一[2]。哮喘患者反复发生的气道炎症,引起肺组织损伤以及不正常修复,最终导致气道壁结构和功能发生改变,这一过程被称为气道重塑。气道重塑是引起哮喘患者不可逆性气流受限、肺功能下降和治疗效果不佳的主要原因[3]。转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)/Smad3信号通路在哮喘气道重塑过程中起着重要作用[4]。NLRP3炎性小体是一种由NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor protein3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱天冬氨酸蛋白酶1前体(pro-caspase-1)组成的多蛋白复合物,对微生物感染、内源性危险信号和环境刺激等作出反应。组装的NLRP3炎性小体可激活蛋白酶1(Caspase-1)诱导消皮素D(gasdermin D, GSDMD)依赖性细胞焦亡,促进IL-1β和IL-18的释放,有助于先天性免疫防御和稳态维持[5]。最新的研究表明,通过NLRP3炎性小体的激活和GSDMD切割,引起支气管上皮细胞焦亡,可加剧过敏原诱导的哮喘气道炎症反应和气道高反应性的发生。NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡是哮喘治疗的潜在靶点[6]。但NLRP3炎性小体在哮喘气道重塑中的具体作用和机制尚不清楚。本研究通过鸡卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)诱导制备哮喘小鼠模型,使用NLRP3特异性抑制剂MCC950进行干预,观察NLRP3炎性小体对TGF-β1/Smad3信号通路的调控作用及对哮喘气道重塑影响的可能机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要实验试剂 鸡卵清白蛋白(A5503,V级,美国Sigma公司);氢氧化铝凝胶(vac-alu-250,美国invivogen公司);MCC950(HY-12815A,美国MedchemExpess公司);AB-PAS 染色试剂盒(G1285,北京索莱宝生物技术有限公司);IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒(JL18442、JL20253,上海江莱生物技术有限公司);兔抗小鼠Anti-NLRP3 抗体(GTX00763,美国GeneTex 公司);兔抗小鼠重组Anti-TGF-β1抗体、兔抗小鼠Anti-Smad3抗体、山羊抗兔IgG HRP(ab215715、ab84177、ab6721,英国abcam公司);RNAiso Reagent、qRT-PCR试剂盒(RR820A、RR037A,大连TaKaRa公司);NLRP3和β-actin引物(北京擎科生物有限公司);Anti-Beta Actin抗体、二抗HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG Goat Polyclonal Antibody(EM21002、HA1001,华安生物);高效RIPA组织裂解液、PMSF、10%PAGE 凝胶快速制备试剂盒、Omni-Easy 即用型BCA 蛋白定量试剂盒(PC101、P0100-1mL、PG112-10、ZJ102,上海雅酶生物医药科技有限公司);4×蛋白上样缓冲液(P1015-10mL,北京索莱宝生物技术有限公司);预染蛋白Marker、ECL化学发光试剂盒(WJ102、SQ201,上海雅酶生物医药科技有限公司);脱脂奶粉(A600669-0250,上海生工生物工程有限公司);PVDF膜(美国Milipore公司) ......