健康的气道上皮能够促进气道中的空气运输、屏障功能、粘液纤毛清除和肺免疫反应的调节,是机体呼吸道防御系统的重要屏障,主要由基底细胞、纤毛细胞、刷细胞、杯状细胞、神经内分泌细胞等细胞组成[1-2]。疾病发生时,各细胞功能状态常发生改变。构建与体内自然生长状态相近的体外气道上皮模型,可更好的研究气道慢性疾病机制或外源性毒理评价。目前,气-液界面(air-liquid interface, ALI)培养技术是培养气道上皮的重要方法,ALI培养可形成典型的假复层纤毛柱状上皮结构,分化为纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞[3-4]。虽然ALI培养在国外已有多年研究的历史,但目前国内也只有少数实验室成功建立了该培养体系[5-7],仍存在技术不够成熟,实验结果不一致的问题。而且各实验室采用的方法都不同,包括原代细胞的分离培养、ALI培养基添加成分、预铺胶原类型的选择、细胞的接种密度等都各不相同[8-9]。ALI培养大多选用原代气道上皮细胞,如冀晓丽等[10]用分离的原代细胞成功构建了ALI培养小鼠气道上皮细胞模型,但每次ALI培养,需要大量的实验动物(10～30只小鼠)才可分离足够的原代细胞,存在一定的动物伦理问题。另外,原代细胞数量少,构建的气道上皮模型不足以用于后续各种对比实验的开展。气道上皮的基底细胞具有自我更新和分化潜能,可分化为主要分泌型和多纤毛细胞类型[11]。因此,本实验进行了原代基底细胞的分离、鉴定,细胞传代及ALI培养等实验,从而研究基底细胞的增殖和定向分化,通过细胞扩增构建更多的体外气道上皮模型,为研究各种慢性气道疾病机制和吸入性物质暴露的毒性评价提供了体外实验模型。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 SPF级10～12周成年KM小鼠,由遵义医科大学实验动物中心提供,生产许可证号为SCXK(黔)2021-0002:使用许可证(黔)2021-0004。通过遵义医科大学动物伦理委员会的审查(NO:ZMU21-2309-009)。

    1.2 主要试剂及仪器 Ⅰ型胶原蛋白(CORNING,354236);PneumaCultTM-Ex Plus基础培养基、PneumaCultTM-Ex Plus 50×增补剂(STEMCELL Techsupport,#05040);PneumaCultTM-ALI基础培养基、PneumaCultTM-ALI 10×增补剂、PneumaCultTM-ALI 维持补充剂(STEMCELL Techsupport, #05001);氢化可的松(STEMCELL Techsupport,#74142);肝素(STEMCELL Techsupport, #07980);中性蛋白酶(上海懋康生物科技有限公司,MX1006-100MG);0.25%胰酶-EDTA(上海源培生物科技股份有限公司,S310JV);青霉素-链霉素(Solarbio, P1400);DMEM培养基(gibco,C11995500BT);胎牛血清(SORFA,SH5021);6.5mm Transwell小室(Jet·Biofil, TCS016024);KRT5(proteintech, 28506-1-AP);DAPI(Solarbio,C0065);Triton X-100(BioFroxx,1139ML100);山羊血清(Solarbio,S9070);山羊抗兔荧光二抗(ABclonal, AS05);甲醇(成都金山化学试剂有限公司,20200204);乙酸(重庆川东化工有限公司);4% 多聚甲醛(biosharp, BL539A);多聚赖氨酸(Solarbio,P210);蔗糖(成都金山化学试剂有限公司,20220624);细胞筛(biosharp,BS-40-CS) ......