黎 瑞,陈泽慧,周小仙,余孟飞,杨智芳,李明哲

    (1.遵义医科大学附属医院 医学检验科,贵州 遵义 563099;2.遵义医科大学 检验医学院,贵州 遵义 563099)

    金黄色葡萄球菌是临床上一种重要的病原菌,可引起一系列人类疾病,包括轻微的皮肤感染、严重的组织感染和败血症[1]。目前,主要依靠抗菌药物治疗金黄色葡萄球菌引发的感染。然而,随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)的出现,耐药问题日渐严重[2],该类细菌不但对β-内酰胺类,还对糖肽类、大环内酯类等多种抗菌药物出现了耐药性[3-4],使得临床治疗变得极为困难。因此,开发具有抗MRSA感染的新型药物迫在眉睫。

    在探索新药物的过程中,天然产物一直是重要来源[5]。巴西苏木素(Brazilin,BN)是一种从中药材苏木中分离提取的天然产物,是苏木主要活性成分之一,分子式为C16H14O5。其具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌的作用,同时还具备降血糖和免疫调节等多种生物学活性[6]。研究发现BN对MRSA具有抗菌作用,可导致MRSA细胞膜通透性增加、DNA与RNA等大分子物质外渗增加以及可溶性蛋白表达减少[7]。然而,目前尚无BN通过影响MRSA细胞壁合成来发挥抑菌作用的报道。细胞壁是细菌及植物细胞所特有的结构,可保持细胞的完整性,对细菌的生长和分裂至关重要。参与细菌细胞壁合成过程中的关键酶一直是研发抗菌药物靶标的热点。其中丙氨酸消旋酶(alanine racemase, Alr)是一种吡哆醛-5'-磷酸依赖性细菌酶,参与细菌细胞壁的合成,为其提供肽聚糖交联所必需的前体D-丙氨酸,对细菌的存活至关重要[8-9]。由于人类细胞没有细胞壁结构,而Alr广泛存在于细菌中[10-11]。因此,Alr成为抗菌药物研发的理想靶标。课题组前期研究发现BN能够破坏MRSA细胞壁肽聚糖的合成,在对BN作用MRSA菌株前后的转录组数据进行分析后,发现BN可以下调细胞壁肽聚糖合成过程中D-Ala代谢途径的关键酶Alr的调控基因Alr。因此,基于BN对MRSA有较好的抗菌效果,进一步的探明该效果是通过抑制Alr的活性而发挥的作用,现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂 巴西苏木素(成都普思生物科技股份有限公司),纯度≥98%;细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)、通用型DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN公司);限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ、T4DNA连接酶(大连TaKaRa公司)、蛋白Marker(Solarbio公司)、磷酸吡哆醛(MACKLIN公司)、L-丙氨酸(Solarbio公司)、D-氨基酸氧化酶(Aladdin公司)、4-氨基安替比林(MACKLIN公司)、辣根过氧化物酶(Solarbio公司)、TOOS(MACKLIN公司)、Britton-Robinson缓冲液(北京雷根生物技术有限公司)、Tris-Hcl(Solarbio公司) ......