不同剂量地塞米松对大鼠早期骨密度及成骨细胞凋亡的影响(1)
摘要：目的 观察不同剂量地塞米松短期内对大鼠骨量、成骨细胞自噬及凋亡的改变。方法 40只3月龄SD雌性大鼠，随机分对照组(生理盐水)、小剂量地塞米松组(地塞米松1mg/kg)、中剂量地塞米松组(地塞米松2.5mg/kg)、高剂量地塞米松组(地塞米松5mg/kg)，每组10只，2次/周肌内注射地塞米松或生理盐水，共4周。给药前及给药后采用双能X线骨密度仪测大鼠全身骨密度，免疫组化法检测成骨细胞凋亡蛋白Caspase 3表达，TUNEL染色检测成骨细胞凋亡。结果 ⑴干预4周后，不同剂量地塞米松组的骨密度与对照组无差异(P>0.05)。(2)干预4周，高剂量地塞米松组大鼠成骨细胞凋亡数量高于中剂量、低剂量组和对照组(P<0.05);中剂地塞米松量组大鼠成骨细胞凋亡数量高于对照组(P<0.05);低剂量地塞米松组大鼠成骨细胞凋亡数量与对照组均无差异(P>0.05)。结论 地塞米松干预3月龄SD大鼠4周，大鼠全身骨密度未受明显影响，高剂量地塞米松诱导成骨细胞凋亡增加，骨折风险增加。
关键词：地塞米松;骨密度;成骨细胞;凋亡
糖皮质激素性骨质疏松(Glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是糖皮质激素治疗中最常也是最严重的并发症之一。GIOP是最常见的医源性骨质疏松[1]]。一项大型荟萃分析发现，使用糖皮质激素≥3个月的患者骨密度明显降低，骨折风险明显增加[2]]。在长期使用糖皮质激素治疗风湿性疾病的15例儿童患者中有12位患儿出现背部压缩性骨折疼痛，7位患儿椎体骨折数量≥5[3]。但也有学者认为在首次应用糖皮质激素治疗早期即可出现骨量丢失及骨折风险增加，且与激素治疗剂量及时间相关[4，5]，本研究通过采用不同剂量地塞米松短期干预大鼠，探讨糖皮质激素干预短期内对大鼠骨密度的影响，以及不同剂量地塞米松对大鼠骨组织内成骨细胞凋亡的影响。
1材料与方法
1.1实验动物及分组
3月龄雌性SPF级SD大鼠40只，购于广西医科大学实验中心，合格证号：SYXK 桂 2014-0003，体质量210-250g。按随机数字表法分为对照组(生理盐水组)、小剂量地塞米松组(地塞米松 1mg/kg组)、中剂量地塞米松组(地塞米松 2.5mg/kg组)、高剂量地塞米松组(地塞米松5mg/kg)，每组30只。对照组肌内注射生理盐水，实验组分别肌内注射1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg的地塞米松，左右肢交替注射，2次/周，共4周。广西医科大学实验动物饲养房饲养，温度(22 ± 1)℃，湿度59% ～ 61%，日夜昼律为12 h，自由摄食进水。
1.2骨密度测定
使用PLODIGY型(Lunar公司)双能X线骨密度仪附带的小动物软件测定大鼠骨密度。干预前及干预4周后大鼠腹腔注射10%的水合氯醛3ml/kg，麻醉后测定大鼠全身骨密度。
1.3 成骨细胞凋亡的检测
干预4周后处死大鼠，快速取右侧股骨近干骺端1/3部分，4%多聚甲醛(含1‰DEPC)固定24h，每周2次更换10%EDTA脱钙液，共6周。脱钙结束后TUNEL染色检测成骨细胞的凋亡，骨小梁区域棕色或褐色成骨细胞为阳性细胞。
1.4 主要试剂
地塞米松磷酸钠注射液(1 ml∶ 5 mg，广东三才石岐制药有限公司)，水合氯醛(成都科龙)，焦炭酸二乙酯(sigama)，免疫组化染色试剂盒(KIT-7720，迈新)，TUNEL试剂盒(Roche)。
1.5 统计学分析
数据均以均数标准差(x(-)s)表示，采用SPSS19.0 软件包进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD- t 检验，以P<0.05 为差异有显著性。
2 结果
2.1 地塞米松对大鼠骨密度的影响
干预4周，不同剂量地塞米松组大鼠全身骨密度与干预前相比，各组大鼠全身骨密度均增加(P<0.01)。干预4周后，不同剂量地塞米松组大鼠全身骨密度均与对照组无差异(P>0.05)。见表1。
2.2 地塞米松对成骨细胞凋亡的影响
干预4周后，不同剂量地塞米松组和对照组的大鼠骨组织均可见TUNEL阳性的成骨细胞。高剂量组大鼠骨组织成骨细胞凋亡率明显高于中剂量組、低剂量组和对照组(P<0.05);中剂量组大鼠成骨细胞凋亡高于对照组(P<0.05)，低剂量组大鼠骨组织成骨细胞凋亡率与对照组无差异(P>0.05)，见图1。
3 讨论
骨质疏松及骨折是长期使用糖皮质激素最常见且不容忽视的并发症。在长期应用糖皮质激素治疗的风湿性疾病患者中，腰椎及股骨颈的骨质疏松率分别高达35%和29%[6]。研究认为在糖皮质激素治疗早期，即可出现骨丢失及骨折风险增加，且与糖皮质激素的剂量有关[7]。分别使用不同剂量泼尼松龙
(2mg/kg、20mg/kg)干预3月龄Wistar大鼠4周后，糖皮质激素干预组大鼠骨形成及骨吸收均比对照组活跃，大鼠松质骨及皮质骨的骨密度均未下降[8]。我们前期研究也发现，分别用1mg/kg，2.5mg/kg，5mg/kg地塞米松干预SD大鼠4周，不同剂量地塞米松组大鼠骨密度与对照组相比无差异[9]。另一研究采取同样的地塞米松剂量干预大鼠4周后，不同剂量组大鼠骨组织碱性磷酸酶及I型胶原蛋白表达与对照组无差异，说明地塞米松短期的作用对大鼠的骨形成无明显抑制作用，对大鼠的骨密度未产生不良影响[10]。本研究结果表明，采用地塞米松干预3月龄SD大鼠4周后，大鼠骨密度未见降低，骨量无明显丢失。
本研究采用地塞米松干预3月龄SD雌性大鼠4周大鼠全身骨密度暂未见下降，但在细胞水平已出现凋亡增加，且成骨细胞凋亡数量随着地塞米松剂量增加而增加，Yao等人也发现高剂量GCs诱导成骨细胞凋亡增加[11]。我们的研究结果不仅与“GCs治疗早期即使患者骨密度无明显下降，但骨折风险仍增加[7，12]”的观点相符合，也与“GCs治疗尽可能采用小剂量，应用大剂量GCs会造成骨折风险增加[13]”的观点相对应。, 百拇医药(吴丽婷 蔡劲薇 潘吉铭 伍龙果 梁敏)
关键词：地塞米松;骨密度;成骨细胞;凋亡
糖皮质激素性骨质疏松(Glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是糖皮质激素治疗中最常也是最严重的并发症之一。GIOP是最常见的医源性骨质疏松[1]]。一项大型荟萃分析发现，使用糖皮质激素≥3个月的患者骨密度明显降低，骨折风险明显增加[2]]。在长期使用糖皮质激素治疗风湿性疾病的15例儿童患者中有12位患儿出现背部压缩性骨折疼痛，7位患儿椎体骨折数量≥5[3]。但也有学者认为在首次应用糖皮质激素治疗早期即可出现骨量丢失及骨折风险增加，且与激素治疗剂量及时间相关[4，5]，本研究通过采用不同剂量地塞米松短期干预大鼠，探讨糖皮质激素干预短期内对大鼠骨密度的影响，以及不同剂量地塞米松对大鼠骨组织内成骨细胞凋亡的影响。
1材料与方法
1.1实验动物及分组
3月龄雌性SPF级SD大鼠40只，购于广西医科大学实验中心，合格证号：SYXK 桂 2014-0003，体质量210-250g。按随机数字表法分为对照组(生理盐水组)、小剂量地塞米松组(地塞米松 1mg/kg组)、中剂量地塞米松组(地塞米松 2.5mg/kg组)、高剂量地塞米松组(地塞米松5mg/kg)，每组30只。对照组肌内注射生理盐水，实验组分别肌内注射1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg的地塞米松，左右肢交替注射，2次/周，共4周。广西医科大学实验动物饲养房饲养，温度(22 ± 1)℃，湿度59% ～ 61%，日夜昼律为12 h，自由摄食进水。
1.2骨密度测定
使用PLODIGY型(Lunar公司)双能X线骨密度仪附带的小动物软件测定大鼠骨密度。干预前及干预4周后大鼠腹腔注射10%的水合氯醛3ml/kg，麻醉后测定大鼠全身骨密度。
1.3 成骨细胞凋亡的检测
干预4周后处死大鼠，快速取右侧股骨近干骺端1/3部分，4%多聚甲醛(含1‰DEPC)固定24h，每周2次更换10%EDTA脱钙液，共6周。脱钙结束后TUNEL染色检测成骨细胞的凋亡，骨小梁区域棕色或褐色成骨细胞为阳性细胞。
1.4 主要试剂
地塞米松磷酸钠注射液(1 ml∶ 5 mg，广东三才石岐制药有限公司)，水合氯醛(成都科龙)，焦炭酸二乙酯(sigama)，免疫组化染色试剂盒(KIT-7720，迈新)，TUNEL试剂盒(Roche)。
1.5 统计学分析
数据均以均数标准差(x(-)s)表示，采用SPSS19.0 软件包进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD- t 检验，以P<0.05 为差异有显著性。
2 结果
2.1 地塞米松对大鼠骨密度的影响
干预4周，不同剂量地塞米松组大鼠全身骨密度与干预前相比，各组大鼠全身骨密度均增加(P<0.01)。干预4周后，不同剂量地塞米松组大鼠全身骨密度均与对照组无差异(P>0.05)。见表1。
2.2 地塞米松对成骨细胞凋亡的影响
干预4周后，不同剂量地塞米松组和对照组的大鼠骨组织均可见TUNEL阳性的成骨细胞。高剂量组大鼠骨组织成骨细胞凋亡率明显高于中剂量組、低剂量组和对照组(P<0.05);中剂量组大鼠成骨细胞凋亡高于对照组(P<0.05)，低剂量组大鼠骨组织成骨细胞凋亡率与对照组无差异(P>0.05)，见图1。
3 讨论
骨质疏松及骨折是长期使用糖皮质激素最常见且不容忽视的并发症。在长期应用糖皮质激素治疗的风湿性疾病患者中，腰椎及股骨颈的骨质疏松率分别高达35%和29%[6]。研究认为在糖皮质激素治疗早期，即可出现骨丢失及骨折风险增加，且与糖皮质激素的剂量有关[7]。分别使用不同剂量泼尼松龙
(2mg/kg、20mg/kg)干预3月龄Wistar大鼠4周后，糖皮质激素干预组大鼠骨形成及骨吸收均比对照组活跃，大鼠松质骨及皮质骨的骨密度均未下降[8]。我们前期研究也发现，分别用1mg/kg，2.5mg/kg，5mg/kg地塞米松干预SD大鼠4周，不同剂量地塞米松组大鼠骨密度与对照组相比无差异[9]。另一研究采取同样的地塞米松剂量干预大鼠4周后，不同剂量组大鼠骨组织碱性磷酸酶及I型胶原蛋白表达与对照组无差异，说明地塞米松短期的作用对大鼠的骨形成无明显抑制作用，对大鼠的骨密度未产生不良影响[10]。本研究结果表明，采用地塞米松干预3月龄SD大鼠4周后，大鼠骨密度未见降低，骨量无明显丢失。
本研究采用地塞米松干预3月龄SD雌性大鼠4周大鼠全身骨密度暂未见下降，但在细胞水平已出现凋亡增加，且成骨细胞凋亡数量随着地塞米松剂量增加而增加，Yao等人也发现高剂量GCs诱导成骨细胞凋亡增加[11]。我们的研究结果不仅与“GCs治疗早期即使患者骨密度无明显下降，但骨折风险仍增加[7，12]”的观点相符合，也与“GCs治疗尽可能采用小剂量，应用大剂量GCs会造成骨折风险增加[13]”的观点相对应。, 百拇医药(吴丽婷 蔡劲薇 潘吉铭 伍龙果 梁敏)