黑热病诊断标准及处理原则GB 15986—1995
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参见附件(40KB)。
黑热病诊断标准及处理原则GB 15986-1995
根据《中华人民共和国传染病防治法》及《中华人民共和国传染病防治法实施办法》制订本标准。
1 主题内容与适用范围
本标准规定了黑热病的诊断标准、治疗方法及防治原则。
本标准适用于疫区专业机构开展黑热病防治工作和全国各级各类医疗卫生机构对黑热病患者的诊治。
2 诊断原则
根据流行病学史、临床表现以及寄生虫学检查和血清免疫学方法，予以诊断。
3 诊断标准
3.1 黑热病
黑热病通过白蛉叮咬而传播，主要病变发生在内脏，少数特殊病例则以皮肤损害或单纯淋巴结肿大为主要症状，分别称皮肤或淋巴结型黑热病。狗也可患此病，称犬内脏利什曼病，是我国山丘地区黑热病的主要动物宿主，当地人的感染大多来自病犬。
3.1.1 黑热病流行区内的居民，或在白蛉季节内(5～9月)曾进入流行区居住过的人员。
3.1.2 长期不规则发热，脾脏呈进行性肿大，肝脏轻度或中度肿大，白细胞计数降低，贫血，血小板减少或有鼻衄及齿龈出血等症状。
3.1.3 在骨髓、脾或淋巴结等穿刺物涂片上查见利什曼原虫，或将穿刺物注入三恩氏(NNN)培养基内培养出利什曼原虫的前鞭毛体(详见附录A)。
3.1.4
用间接荧光抗体试验(IFA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，PVC薄膜快速ELISA，间接血凝(IHA)等方法检测抗体呈阳性反应；或用单克隆抗体斑点-ELISA(McAb斑点-ELISA直接法)或单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AST法)以及单克隆抗体-酶联免疫电泳转移印斑试验(EITB)检测循环抗原呈阳性反应(详见附录B)。
疑似病例：具备3.1.1，3.1.2条。
确诊病例：疑似病例加3.1.3条。
临床诊断：疑似病例加3.1.4条。
3.2 皮肤型黑热病
3.2.1 多数病例在数年或十余年前有黑热病史，也可发生在黑热病病程中；少数患者无黑热病史，为原发性病例。
3.2.2 在面、四肢或躯干部有皮肤结节、丘疹和红斑，偶见褪色斑，白细胞计数可增至10000/mm(上标始)3(上标终)，嗜酸性粒细胞常在5%以上。
3.2.3 从结节、丘疹处吸取的组织液或皮肤组织刮取物的涂片上查见利什曼原虫。
3.2.4 McAb dot-ELISA法检测循环抗原呈阳性反应
疑似病例：具备3.2.1，3.2.2条。
确诊病例：疑似病例加3.2.3条。
临床诊断：疑似病例加3.2.4条。
3.3 淋巴结型黑热病
3.3.1 病人多发生在白蛉季节内由非流行区进入以婴幼儿发病为主的黑热病流行区(荒漠、山丘地带)居住或旅游的成年人中。
3.3.2 颈、耳后、腋窝、腹股沟或滑车上的淋巴结肿大如花生米至蚕豆般大小，较浅，可移动。肝脾不肿大，嗜酸粒细胞增多。
3.3.3 从肿大的淋巴结吸取组织液涂片检查或从淋巴结的组织切片上查见利什曼原虫。
疑似病例：具备3.3.1，3.3.2条。
确诊病例：疑似病例加3.3.3条。
4 处理原则
4.1 治疗(详见附录C)
4.1.1 黑热病
4.1.1.1 初治病例：
斯锑黑克(五价葡萄糖酸锑钠)六日疗法：成人总量120～150mg锑/kg，儿童总量200～240mg锑/kg，平分6次，每日肌肉或静脉注射一次，6天为一疗程。斯锑黑克三周疗法：成人总量133mg锑/kg，儿童总量200mg锑/kg，平分6次，每周肌肉或静脉注射2次，三周完毕一疗程。此法适用于体质差或病情较重的患者。
4.1.1.2 经一疗程未愈或复发病人：斯锑黑克的剂量应在六日疗法的基础上加大1/3，改用八日疗法进行治疗。
4.1.1.3
对锑剂有抗性的病例，任选以下一种方案：戊脘脒4mg/kg每日或隔日肌肉注射一次，总量为60mg/kg；羟脒芪每次2～3mg/kg肌肉或静脉注射，总量为85mg/kg。
4.1.2 皮肤型黑热病
斯锑黑克六日或八日疗法，连续2～3个疗程。戊脘脒疗效较好，每次4mg/kg，肌肉注射，总量为60～80mg/kg，一般即可治愈。如皮肤损害仍未完全消失，可再给予一疗程。
4.1.3 淋巴结型黑热病
斯锑黑克剂量和疗程同4.1.1.1。
4.2 预防
4.2.1
消灭病犬：山丘地带的黑热病流行区，应及时使用寄生虫学检查和血清免疫学方法查出感染内脏利什曼病的犬，加以杀灭。在病犬较多的地区，应动员群众少养或不养家犬。
4.2.2
灭蛉：在仍有黑热病流行的平原地区，经监测如媒介白蛉的密度较高，应使用杀虫剂于白蛉季节初喷洒住屋和畜舍。在山丘、荒漠地带在白蛉季节内查见病人后，可用杀虫剂喷洒病家及其四周半径15m之内的住屋和畜舍，以歼灭自野外入侵室内的白蛉。
4.2.3 防蛉
使用蚊帐、蚊香，燃点干燥的野艾烟薰驱蛉；不露宿，提倡装置细孔纱门纱窗。在山丘地带的黑热病疫区内，可在白蛉季节内用杀虫剂(如溴氰菊酯等)喷淋犬体，以杀死或驱除前来刺叮吸血的白蛉。夜间在荒漠地带野外的执勤人员，应在身体裸露部位涂擦驱避剂。
附录A
病原学诊断
(补充件)
A1 病原检查
A1.1 髂骨穿刺
A1.1.1 病人侧卧，露出髂骨部位，用手指确定髂骨上棘，将该处周围皮肤用碘酒及酒精消毒，一般在局部麻醉下进行。
A1.1.2
穿刺针的大小，视病人年龄不同而异，婴儿及幼童用20号穿刺针，年龄较大的儿童及青年可用5cm长的18号腰椎穿刺针，成人用17号穿刺针，均需经压力蒸气灭菌。
A1.1.3
以髂骨前上棘后约1cm为穿刺处，先刺入皮肤，然后将针竖起，使与水平线成70°～80°，穿过皮下组织及骨膜后，即能觉出针头已触及骨的表面，可用旋转式的动作，将针尖钻入骨内。
A1.1.4
按病人年龄大小及胖瘦不同，穿刺的深度为0.5～1.0cm，由浅入深，只要放手后针不斜倒，表示针尖已入骨内，可将针轴拔出，接以2mL或5mL注射器，抽得骨髓后，应立即将穿刺针拔出，将骨髓制成涂片以便检查。
A1.1.5
骨髓涂片制成后让其自然干燥，用记号笔编号。染色前先用甲醇固定，将吉氏液以水配制成3%的稀释液，染色30min，或在2mL水中加吉氏液3滴，滴在涂片上，染色20min。然后用流水轻轻冲洗晾干，即可用光学显微镜(油镜)检查。
A1.2 淋巴结穿刺
A1.2.1 一般均选择腹股沟部位，其他部位的淋巴结如属肿大，亦可用作穿刺。
A1.2.2
淋巴结肿大处的局部消毒后，用洗净的左手拇指和食指捏住一个淋巴结，向上提起，并使其固定于两指之间，注意穿刺部位不得污染。右手取高压消毒的针头，先穿过皮肤，然后刺入淋巴结内，待数秒钟后即可将针头拔出，无需用针筒抽吸。
A1.2.3 将针内的淋巴组织液射在玻片上，由于所获的液体量甚少，应仔细作成涂片。
A1.2.4 涂片染色镜检：参见A1.1.5。
A1.3 皮肤刮片检查
局部皮肤消毒后，以洗净的左手拇指和食指捏住皮肤结节，使其固定于两指间，再用灭菌干燥手术刀轻轻切开皮肤，刮取切口两侧的皮肤组织，制成涂片，染色镜检。
A1.4
三恩基的制备：琼脂14.0g，氯化钠6.0g，蒸馏水900mL，盛入烧瓶中加热熔化，分装试管，每管3mL。经压力蒸气灭菌，待稍冷却后每试管加入相当1/3量的去纤维兔血，均匀混合后斜置待冷。冷却后每管加入0.5mL洛克氏溶液，4℃冷藏备用。
A1.5
原虫培养：在严格的无菌操作下，把抽吸到的骨髓、淋巴液注入培养基内，或切取皮肤黑热病患者的小块皮肤组织投入三恩基内，置22～24℃温箱内培养，15天后用白金耳取少量培养液置显微镜下检查，如查见利什曼原虫的前鞭毛体，即可确定诊断。
附录B
血清学诊断
(补充件)
B1 检测抗体
B1.1 间接荧光抗体试验(IFA)
一般以病人血清作试验。婴、幼儿病例因采血不便，可用滤纸干血滴法。
B1.1.1
抗原片：收集经三恩氏(NNN)基培养10天左右的利什曼原虫前鞭毛体，离心沉淀(3000r/min)15min，弃上清液，加生理盐水冲匀，再经离心洗涤3次后，用含0.2%福尔马林0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定，置冰箱内1h取出，离心沉淀，弃上清，再用PBS洗涤一次，稀释至每个视野50～100个鞭毛体，滴于玻片上，电扇吹干。此抗原片，可置-20℃冰箱中备用。
B1.1.2
干血滴的制备：在滤纸上圈画1.2cm直径的圆圈，在圈内滴入2滴(相当于20mm(上标始)3(上标终))病人耳垂血，晾干后放入装有干燥剂的塑料袋内，置冰箱保存待查。
B1.1.3 从滤纸上剪下干血滴，以0.2mL0.01mol/L
pH7.2的PBS浸泡，相当于1∶20血清的稀释度(如被检样本为血清，则作1∶20稀释)，置冰箱内过夜。试验时继续作倍比稀释至1∶320或1∶640，把不同稀释度的血清或干血滴浸泡液分别滴在抗原片上，置湿盒内于37℃温育30min后，用pH7.2～8.0的PBS缓慢洗去血清或干血滴浸泡液，再以PBS浸泡10min，继续用蒸馏水洗一次，电扇吹干。
B1.1.4 分别滴加1∶10稀释的荧光标记的羊抗人IgG，置湿盒内于37℃温育30min，如前清洗，电扇吹干待检。
B1.1.5
检查时在玻片上加蒸馏水一滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜或用6×40倍的光学显微镜在高压汞灯荧光光源的配合下进行观察。阳性者虫体的胞浆及鞭毛呈黄绿色荧光，轮廓清楚，而核及动基体一般不显荧光。
B1.1.6
每次试验均以病人干血滴(或血清)和正常人干血滴(或血清)浸泡液及PBS作对照，由于正常人血样在1∶20稀释时亦偶可出现"+"，故以"++"为阳性标准，并以1∶20(即1∶20++)为最低阳性稀释度。
B1.2 PVC薄膜快速ELISA
B1.2.1
抗原(前鞭毛体可溶性抗原)：收集利什曼原虫前鞭毛体，以生理盐水离心洗涤3次，按压积体积加10倍量的0.01%硫柳汞生理盐水，在冰浴中超声处理2次，每次10min，反复冻融5次，经4000r/min离心3min，上清液存-20℃贮存备用。
B1.2.2 操作方法：
B1.2.2.1 实验前先在PVC致敏膜背面上编号，然后每孔加血清稀释液(PBS/T)0.2mL。
B1.2.2.2 按编号加入待测血清及参考血清(每批设一个阴性对照，一个阳性对照)，每孔10μL，混匀置37℃
5min(如放25℃室温，则需10min)。
B1.2.2.3 温育后，倾去稀释血清，用洗涤液(NaCl/T)连续洗8次，空干。
B1.2.2.4 加入按工作浓度稀释的酶结合物，每孔0.2mL，放37℃内5min。
B1.2.2.5 倾去酶结合物，先用洗涤液洗8次，再用蒸馏水洗一次，空干。
B1.2.2.6
加入已加3%过氧化氢(H(下标始)2(下标终)O(下标始)2(下标终))的四甲基联苯胺(TMBs)底物液，每孔0.2mL，反应5～10min，即可观察结果。
B1.2.3 反应标准：
目视判断：按每批的阳性对照及阴性对照判断结果。阳性为鲜蓝色，阴性基本无色。
分光光度计比色判断：不用过氧化氢(H(下标始)2(下标终)O(下标始)2(下标终))终止，选用595nm波长比色，以P/N≥
2.1判为阳性(P-患者的光密度值；N-正常人的光密度值)。
B1.3 间接血凝法(IHA)
B1.3.1
取培养10～12天的利什曼原虫前鞭毛体，用生理盐水洗涤，按压积量加4倍生理盐水，于冰浴中用150W，18kc，300mA功率超声处理10s，以pH6.4，0.075mol/L的PBS稀释20倍。Folin酚试法测蛋白量为200μg/mL。
B1.3.2
醛化：用健康人"O"型红细胞加10倍生理盐水离心4～5次。每8mL压积红细胞加1%戊二醛100mL，在4℃水浴中摇动30min，醛化红细胞再用生理盐水和蒸馏水或去离子水各洗5次，最后稀释成15%，另加万分之一硫柳汞防腐，置冰箱内保存。
B1.3.3
致敏：用pH7.2，0.75mol/L的PBS将醛化红细胞稀释为1.5%，离心洗3次，配成5%的细胞悬液加等量万分之一的鞣酸溶液，置37℃水浴中30min，每3～5min摇一次，用5倍量上述的PBS洗3次，再用pH6.4，0.075mol/L的PBS配成2.5%的红细胞悬液，然后以此红细胞悬液加等量pH6.4的PBS稀释20倍的抗原，在37℃水浴中致敏45min，并加摇动，2000r/min离心3min后弃上清，加pH7.2的PBS重复离心一次，最后以含有1%正常兔血清的pH7.2的PBS配成1%备用。
B1.3.4
将定量生理盐水滴加于稀释板上，于第一孔内加等量待检血清，混匀并倍比稀释成2(上标始)-1(上标终)，2(上标始)-2(上标终)...2(上标始)-12(上标终)等浓度。取每一浓度血清0.025mL分别加入微量血凝板的12个6mm×7mm的"V"井内，再加等量致敏红细胞摇匀，置于湿纱布盒内，经室温1h后判定结果，同时用参考阳性和阴性血清作对照。凡患者血清稀释度达2(上标始)-7(上标终)凝集者作阳性阈值，无凝集者为阴性反应。
B2 检测循环抗原
B2.1 单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AST)
B2.1.1 待检血清递次作倍比稀释，分别取2μL滴于硝化纤维滤膜(0.45μm)上，室温放置30min。......（后略) ......
黑热病诊断标准及处理原则GB 15986-1995
根据《中华人民共和国传染病防治法》及《中华人民共和国传染病防治法实施办法》制订本标准。
1 主题内容与适用范围
本标准规定了黑热病的诊断标准、治疗方法及防治原则。
本标准适用于疫区专业机构开展黑热病防治工作和全国各级各类医疗卫生机构对黑热病患者的诊治。
2 诊断原则
根据流行病学史、临床表现以及寄生虫学检查和血清免疫学方法，予以诊断。
3 诊断标准
3.1 黑热病
黑热病通过白蛉叮咬而传播，主要病变发生在内脏，少数特殊病例则以皮肤损害或单纯淋巴结肿大为主要症状，分别称皮肤或淋巴结型黑热病。狗也可患此病，称犬内脏利什曼病，是我国山丘地区黑热病的主要动物宿主，当地人的感染大多来自病犬。
3.1.1 黑热病流行区内的居民，或在白蛉季节内(5～9月)曾进入流行区居住过的人员。
3.1.2 长期不规则发热，脾脏呈进行性肿大，肝脏轻度或中度肿大，白细胞计数降低，贫血，血小板减少或有鼻衄及齿龈出血等症状。
3.1.3 在骨髓、脾或淋巴结等穿刺物涂片上查见利什曼原虫，或将穿刺物注入三恩氏(NNN)培养基内培养出利什曼原虫的前鞭毛体(详见附录A)。
3.1.4
用间接荧光抗体试验(IFA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，PVC薄膜快速ELISA，间接血凝(IHA)等方法检测抗体呈阳性反应；或用单克隆抗体斑点-ELISA(McAb斑点-ELISA直接法)或单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AST法)以及单克隆抗体-酶联免疫电泳转移印斑试验(EITB)检测循环抗原呈阳性反应(详见附录B)。
疑似病例：具备3.1.1，3.1.2条。
确诊病例：疑似病例加3.1.3条。
临床诊断：疑似病例加3.1.4条。
3.2 皮肤型黑热病
3.2.1 多数病例在数年或十余年前有黑热病史，也可发生在黑热病病程中；少数患者无黑热病史，为原发性病例。
3.2.2 在面、四肢或躯干部有皮肤结节、丘疹和红斑，偶见褪色斑，白细胞计数可增至10000/mm(上标始)3(上标终)，嗜酸性粒细胞常在5%以上。
3.2.3 从结节、丘疹处吸取的组织液或皮肤组织刮取物的涂片上查见利什曼原虫。
3.2.4 McAb dot-ELISA法检测循环抗原呈阳性反应
疑似病例：具备3.2.1，3.2.2条。
确诊病例：疑似病例加3.2.3条。
临床诊断：疑似病例加3.2.4条。
3.3 淋巴结型黑热病
3.3.1 病人多发生在白蛉季节内由非流行区进入以婴幼儿发病为主的黑热病流行区(荒漠、山丘地带)居住或旅游的成年人中。
3.3.2 颈、耳后、腋窝、腹股沟或滑车上的淋巴结肿大如花生米至蚕豆般大小，较浅，可移动。肝脾不肿大，嗜酸粒细胞增多。
3.3.3 从肿大的淋巴结吸取组织液涂片检查或从淋巴结的组织切片上查见利什曼原虫。
疑似病例：具备3.3.1，3.3.2条。
确诊病例：疑似病例加3.3.3条。
4 处理原则
4.1 治疗(详见附录C)
4.1.1 黑热病
4.1.1.1 初治病例：
斯锑黑克(五价葡萄糖酸锑钠)六日疗法：成人总量120～150mg锑/kg，儿童总量200～240mg锑/kg，平分6次，每日肌肉或静脉注射一次，6天为一疗程。斯锑黑克三周疗法：成人总量133mg锑/kg，儿童总量200mg锑/kg，平分6次，每周肌肉或静脉注射2次，三周完毕一疗程。此法适用于体质差或病情较重的患者。
4.1.1.2 经一疗程未愈或复发病人：斯锑黑克的剂量应在六日疗法的基础上加大1/3，改用八日疗法进行治疗。
4.1.1.3
对锑剂有抗性的病例，任选以下一种方案：戊脘脒4mg/kg每日或隔日肌肉注射一次，总量为60mg/kg；羟脒芪每次2～3mg/kg肌肉或静脉注射，总量为85mg/kg。
4.1.2 皮肤型黑热病
斯锑黑克六日或八日疗法，连续2～3个疗程。戊脘脒疗效较好，每次4mg/kg，肌肉注射，总量为60～80mg/kg，一般即可治愈。如皮肤损害仍未完全消失，可再给予一疗程。
4.1.3 淋巴结型黑热病
斯锑黑克剂量和疗程同4.1.1.1。
4.2 预防
4.2.1
消灭病犬：山丘地带的黑热病流行区，应及时使用寄生虫学检查和血清免疫学方法查出感染内脏利什曼病的犬，加以杀灭。在病犬较多的地区，应动员群众少养或不养家犬。
4.2.2
灭蛉：在仍有黑热病流行的平原地区，经监测如媒介白蛉的密度较高，应使用杀虫剂于白蛉季节初喷洒住屋和畜舍。在山丘、荒漠地带在白蛉季节内查见病人后，可用杀虫剂喷洒病家及其四周半径15m之内的住屋和畜舍，以歼灭自野外入侵室内的白蛉。
4.2.3 防蛉
使用蚊帐、蚊香，燃点干燥的野艾烟薰驱蛉；不露宿，提倡装置细孔纱门纱窗。在山丘地带的黑热病疫区内，可在白蛉季节内用杀虫剂(如溴氰菊酯等)喷淋犬体，以杀死或驱除前来刺叮吸血的白蛉。夜间在荒漠地带野外的执勤人员，应在身体裸露部位涂擦驱避剂。
附录A
病原学诊断
(补充件)
A1 病原检查
A1.1 髂骨穿刺
A1.1.1 病人侧卧，露出髂骨部位，用手指确定髂骨上棘，将该处周围皮肤用碘酒及酒精消毒，一般在局部麻醉下进行。
A1.1.2
穿刺针的大小，视病人年龄不同而异，婴儿及幼童用20号穿刺针，年龄较大的儿童及青年可用5cm长的18号腰椎穿刺针，成人用17号穿刺针，均需经压力蒸气灭菌。
A1.1.3
以髂骨前上棘后约1cm为穿刺处，先刺入皮肤，然后将针竖起，使与水平线成70°～80°，穿过皮下组织及骨膜后，即能觉出针头已触及骨的表面，可用旋转式的动作，将针尖钻入骨内。
A1.1.4
按病人年龄大小及胖瘦不同，穿刺的深度为0.5～1.0cm，由浅入深，只要放手后针不斜倒，表示针尖已入骨内，可将针轴拔出，接以2mL或5mL注射器，抽得骨髓后，应立即将穿刺针拔出，将骨髓制成涂片以便检查。
A1.1.5
骨髓涂片制成后让其自然干燥，用记号笔编号。染色前先用甲醇固定，将吉氏液以水配制成3%的稀释液，染色30min，或在2mL水中加吉氏液3滴，滴在涂片上，染色20min。然后用流水轻轻冲洗晾干，即可用光学显微镜(油镜)检查。
A1.2 淋巴结穿刺
A1.2.1 一般均选择腹股沟部位，其他部位的淋巴结如属肿大，亦可用作穿刺。
A1.2.2
淋巴结肿大处的局部消毒后，用洗净的左手拇指和食指捏住一个淋巴结，向上提起，并使其固定于两指之间，注意穿刺部位不得污染。右手取高压消毒的针头，先穿过皮肤，然后刺入淋巴结内，待数秒钟后即可将针头拔出，无需用针筒抽吸。
A1.2.3 将针内的淋巴组织液射在玻片上，由于所获的液体量甚少，应仔细作成涂片。
A1.2.4 涂片染色镜检：参见A1.1.5。
A1.3 皮肤刮片检查
局部皮肤消毒后，以洗净的左手拇指和食指捏住皮肤结节，使其固定于两指间，再用灭菌干燥手术刀轻轻切开皮肤，刮取切口两侧的皮肤组织，制成涂片，染色镜检。
A1.4
三恩基的制备：琼脂14.0g，氯化钠6.0g，蒸馏水900mL，盛入烧瓶中加热熔化，分装试管，每管3mL。经压力蒸气灭菌，待稍冷却后每试管加入相当1/3量的去纤维兔血，均匀混合后斜置待冷。冷却后每管加入0.5mL洛克氏溶液，4℃冷藏备用。
A1.5
原虫培养：在严格的无菌操作下，把抽吸到的骨髓、淋巴液注入培养基内，或切取皮肤黑热病患者的小块皮肤组织投入三恩基内，置22～24℃温箱内培养，15天后用白金耳取少量培养液置显微镜下检查，如查见利什曼原虫的前鞭毛体，即可确定诊断。
附录B
血清学诊断
(补充件)
B1 检测抗体
B1.1 间接荧光抗体试验(IFA)
一般以病人血清作试验。婴、幼儿病例因采血不便，可用滤纸干血滴法。
B1.1.1
抗原片：收集经三恩氏(NNN)基培养10天左右的利什曼原虫前鞭毛体，离心沉淀(3000r/min)15min，弃上清液，加生理盐水冲匀，再经离心洗涤3次后，用含0.2%福尔马林0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定，置冰箱内1h取出，离心沉淀，弃上清，再用PBS洗涤一次，稀释至每个视野50～100个鞭毛体，滴于玻片上，电扇吹干。此抗原片，可置-20℃冰箱中备用。
B1.1.2
干血滴的制备：在滤纸上圈画1.2cm直径的圆圈，在圈内滴入2滴(相当于20mm(上标始)3(上标终))病人耳垂血，晾干后放入装有干燥剂的塑料袋内，置冰箱保存待查。
B1.1.3 从滤纸上剪下干血滴，以0.2mL0.01mol/L
pH7.2的PBS浸泡，相当于1∶20血清的稀释度(如被检样本为血清，则作1∶20稀释)，置冰箱内过夜。试验时继续作倍比稀释至1∶320或1∶640，把不同稀释度的血清或干血滴浸泡液分别滴在抗原片上，置湿盒内于37℃温育30min后，用pH7.2～8.0的PBS缓慢洗去血清或干血滴浸泡液，再以PBS浸泡10min，继续用蒸馏水洗一次，电扇吹干。
B1.1.4 分别滴加1∶10稀释的荧光标记的羊抗人IgG，置湿盒内于37℃温育30min，如前清洗，电扇吹干待检。
B1.1.5
检查时在玻片上加蒸馏水一滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜或用6×40倍的光学显微镜在高压汞灯荧光光源的配合下进行观察。阳性者虫体的胞浆及鞭毛呈黄绿色荧光，轮廓清楚，而核及动基体一般不显荧光。
B1.1.6
每次试验均以病人干血滴(或血清)和正常人干血滴(或血清)浸泡液及PBS作对照，由于正常人血样在1∶20稀释时亦偶可出现"+"，故以"++"为阳性标准，并以1∶20(即1∶20++)为最低阳性稀释度。
B1.2 PVC薄膜快速ELISA
B1.2.1
抗原(前鞭毛体可溶性抗原)：收集利什曼原虫前鞭毛体，以生理盐水离心洗涤3次，按压积体积加10倍量的0.01%硫柳汞生理盐水，在冰浴中超声处理2次，每次10min，反复冻融5次，经4000r/min离心3min，上清液存-20℃贮存备用。
B1.2.2 操作方法：
B1.2.2.1 实验前先在PVC致敏膜背面上编号，然后每孔加血清稀释液(PBS/T)0.2mL。
B1.2.2.2 按编号加入待测血清及参考血清(每批设一个阴性对照，一个阳性对照)，每孔10μL，混匀置37℃
5min(如放25℃室温，则需10min)。
B1.2.2.3 温育后，倾去稀释血清，用洗涤液(NaCl/T)连续洗8次，空干。
B1.2.2.4 加入按工作浓度稀释的酶结合物，每孔0.2mL，放37℃内5min。
B1.2.2.5 倾去酶结合物，先用洗涤液洗8次，再用蒸馏水洗一次，空干。
B1.2.2.6
加入已加3%过氧化氢(H(下标始)2(下标终)O(下标始)2(下标终))的四甲基联苯胺(TMBs)底物液，每孔0.2mL，反应5～10min，即可观察结果。
B1.2.3 反应标准：
目视判断：按每批的阳性对照及阴性对照判断结果。阳性为鲜蓝色，阴性基本无色。
分光光度计比色判断：不用过氧化氢(H(下标始)2(下标终)O(下标始)2(下标终))终止，选用595nm波长比色，以P/N≥
2.1判为阳性(P-患者的光密度值；N-正常人的光密度值)。
B1.3 间接血凝法(IHA)
B1.3.1
取培养10～12天的利什曼原虫前鞭毛体，用生理盐水洗涤，按压积量加4倍生理盐水，于冰浴中用150W，18kc，300mA功率超声处理10s，以pH6.4，0.075mol/L的PBS稀释20倍。Folin酚试法测蛋白量为200μg/mL。
B1.3.2
醛化：用健康人"O"型红细胞加10倍生理盐水离心4～5次。每8mL压积红细胞加1%戊二醛100mL，在4℃水浴中摇动30min，醛化红细胞再用生理盐水和蒸馏水或去离子水各洗5次，最后稀释成15%，另加万分之一硫柳汞防腐，置冰箱内保存。
B1.3.3
致敏：用pH7.2，0.75mol/L的PBS将醛化红细胞稀释为1.5%，离心洗3次，配成5%的细胞悬液加等量万分之一的鞣酸溶液，置37℃水浴中30min，每3～5min摇一次，用5倍量上述的PBS洗3次，再用pH6.4，0.075mol/L的PBS配成2.5%的红细胞悬液，然后以此红细胞悬液加等量pH6.4的PBS稀释20倍的抗原，在37℃水浴中致敏45min，并加摇动，2000r/min离心3min后弃上清，加pH7.2的PBS重复离心一次，最后以含有1%正常兔血清的pH7.2的PBS配成1%备用。
B1.3.4
将定量生理盐水滴加于稀释板上，于第一孔内加等量待检血清，混匀并倍比稀释成2(上标始)-1(上标终)，2(上标始)-2(上标终)...2(上标始)-12(上标终)等浓度。取每一浓度血清0.025mL分别加入微量血凝板的12个6mm×7mm的"V"井内，再加等量致敏红细胞摇匀，置于湿纱布盒内，经室温1h后判定结果，同时用参考阳性和阴性血清作对照。凡患者血清稀释度达2(上标始)-7(上标终)凝集者作阳性阈值，无凝集者为阴性反应。
B2 检测循环抗原
B2.1 单克隆抗体-抗原斑点试验(McAb-AST)
B2.1.1 待检血清递次作倍比稀释，分别取2μL滴于硝化纤维滤膜(0.45μm)上，室温放置30min。......（后略) ......
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