收稿日期: 2003210214

    作者简介: 王 刚(19712) , 男, 四川井研人, 佛山市第一

    人民医院副主任医师, 博士, 从事妇科肿瘤诊治研究.

    单纯加温与加温联用顺铂对人卵巢癌

    细胞增殖及凋亡的影响

    王 刚1

    , 郑闻亭2

    , 李晓杰3

    , 肖 平3

    , 林铁成1

    , 李光仪1

    , 庄广伦2

    (1. 佛山市第一人民医院妇产科, 广东 佛山 528000; 2. 中山大学附属第一医院生殖医学科,广东 广州 510089; 3. 佛山市第一人民医院临床医学研究所, 广东 佛山 528000)

    摘要: 目的 探讨单纯加温与联用顺铂(DDP)对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响。方法 采用M TT 法检测加

    温及加温联合DDP 对卵巢癌DDP 敏感细胞系 skov3 和DDP 耐药细胞系SK2 OV 23 细胞增殖的抑制效应, 分析加

    温与DDP 在抑制卵巢癌细胞增殖中的相互作用; 采用TUN EL 和流式细胞术分析加温及加温联合DDP 对卵巢癌

    细胞周期和凋亡的影响, 探讨热化疗的作用机制。结果 42℃以上加温可显著抑制卵巢癌DDP 敏感和耐药细胞系

    细胞增殖(P < 0. 001) , 且与加热温度和时间之间存在剂量效应关系。加热与DDP 在抑制卵巢癌细胞增殖上表现为

    相加或协同作用, 在skov3 细胞系以相加作用(0. 85≤q≤1. 15)为主, 而在SK2 OV 23 细胞系则主要表现为协同作用

    (q> 1. 15)。加温可诱导卵巢癌细胞凋亡, 并降低 S 期细胞比率和增加 G0? G1 期细胞比率。加温与DDP 在诱导

    skov3 细胞凋亡上表现为相加作用(0. 85≤q≤1. 15)。41～ 42℃、 30～ 90 分钟加温与 2. 5 Lg? m l DDP 可协同诱导

    SK2 OV 23 细胞凋亡(q> 1. 15)。结论 热诱导肿瘤细胞凋亡并将细胞阻滞于G0? G1 期是热疗杀伤卵巢癌细胞的重

    要机制。加温与DDP 在诱导卵巢癌细胞凋亡和抑制细胞增殖等作用上具有相加或协同效应。

    关键词: 卵巢肿瘤; 高温, 诱发; 药物疗法; 顺铂; 脱噬作用; 细胞周期

    中图分类号: R737. 31; R73236 文献标识码:A 文章编号: 100121692 (2004) 0520405204

    化疗是卵巢癌综合治疗的重要组成部分, 如何

    提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性, 提高化疗的总

    体效率是当前卵巢癌治疗中亟待解决的问题。腹腔

    热化疗不仅可以增强顺铂(DDP)等铂类化疗药物对

    卵巢癌的细胞毒作用, 并能在一定程度上逆转肿瘤

    细胞的多药耐药性, 但热化疗的具体机制, 特别是温

    热与化疗药物联合应用对卵巢癌细胞凋亡及耐药细

    胞DDP 敏感性的影响尚不清楚。本研究拟通过

    M TT 法检测加温对卵巢癌DDP 敏感及耐药细胞

    生长的影响, 同时采用终末脱氧核糖核苷酸转移酶

    介导的原位缺口末端标记(TUN EL )法和流式细胞

    术分析热化疗对卵巢癌细胞凋亡及细胞周期的影

    响, 以期为临床应用腹腔热化疗治疗卵巢癌提供实

    验依据。

    1 材料与方法

    1 . 1 材料

    1 . 1 . 1 细胞系 人卵巢浆液性腺癌DDP 耐药细胞

    系SK2 OV 23 来自美国A TCC (HTB277) , 对顺铂、多

    柔比星(阿霉素)、肿瘤坏死因子及白喉毒素耐受;

    DDP 敏感细胞系 skov3 由广西医科大学肿瘤医院

    李力教授馈赠。均置于含10%小牛血清和0. 5 m g?

    m l 丁胺卡那霉素的 RPM I21640 全培养液中于

    37℃、 5% CO 2 培养箱中培养。

    1 . 1 . 2 主要试剂 RPM I21640 培养基购自美国

    Gibco 公司,M TT 购自华美公司, 小牛血清购自成都

    生物制品有限公司。DDP 注射液为澳大利亚FH 科

    鼎有限公司产品, 实验时直接用RPM I21640 全培养

    液稀释至所需浓度。A PO 2 D IRECTTM细胞凋亡检测

    试剂盒为Pharm ingen 公司产品, 包括A、 B 两部分,使用时按说明书配置。其它试剂为国产分析纯产品。

    1 . 2 方法

    1 . 2 . 1 温热对卵巢癌细胞增殖的影响 用 0. 25%

    胰蛋白酶(pH 7. 4)消化、收集处于对数生长期的卵

    巢癌细胞, 调整细胞密度为 5×105

    ? m l, 以每孔 200

    Ll 接种于一次性 96 孔培养板, 置 37℃、 5%CO 2 培

    养箱培养, 次日待细胞贴壁后采用水浴法对细胞进

    行加温处理, 加温温度分别为 40、 41、 42、 43、 44 和

    45℃, 加热时间分别为 0 (加入预热培养液后立即转

    入37℃培养)、 30、 60、 90 和120 分钟, 每一处理组设

    6 个复孔, 同时设不加热对照组 6 孔, 无细胞培养液

    对照1 孔。热处理第4 天行M TT 法检测: 每孔加入

    5 m g? m lM TT 20 Ll, 37℃继续孵育 4 小时后弃培

    · 504 · 实用肿瘤杂志2004 年 第19 卷 第5 期

    ? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.养液, 每孔加入二甲基亚砜(DM SO ) 150 Ll, 微量振

    荡器震荡 5 分钟, 用全自动酶标仪检测波长在 490

    nm 时的吸光度(A 490) , 按下述公式计算细胞增殖抑

    制率:

    细胞增殖抑制率=

    无药对照组A 490值- 实验组A 490值

    无药对照组A 490值 ×100%

    1 . 2 . 2 加温合用DDP 对卵巢癌细胞增殖的影响

    按上述方法准备细胞, 细胞贴壁后每孔重新加入预

    热至期望温度并含不同浓度DDP 的RPM I21640 全

    培养液 200 Ll, 使DDP 终浓度分别为 0. 625、 1. 25、2. 5 和5 Lg? m l, 加温温度与时间同上。加设单DDP

    对照和单纯加温对照。热化疗处理后第4 天检测细

    胞增殖抑制率。参照文献[ 1 ]

    用以下公式计算加温与

    DDP 合用结果: q= EHC? [EH+ (1- EH )×EC ]。其中

    EHC为加热与DDP 合用时的生长抑制率, EH 和 EC

    分别为加温和DDP 单用时的生长抑制率, q= 0. 85

    ～ 1. 15 表示加热与DDP 作用相加, q> 1115 表示两

    者具协同作用, q< 0. 85 表示两者相互拮抗。

    1 . 2 . 3 加温合用DDP 对卵巢癌细胞凋亡及细胞周

    期的影响 按前述方法准备细胞, 调整细胞密度为

    5×105

    ? m l, 以每孔 1 m l 接种于一次性 24 孔培养

    板, 细胞贴壁后按前述方法进行加温和热化疗处理。

    DDP 终浓度仅选 2. 5 Lg? m l, 加温温度分别为 41、42 和43℃, 加热时间分别为30、 60 和90 分钟, 每一

    处理组设 5 个复孔, 设无药不加温对照、 2. 5 Lg? m l

    DDP 组和单纯加温处理组。热化疗处理后 24 小时

    收集细胞, 遵照A PO 2 D IRECTTM试剂盒说明书进行

    细胞固定、染色, 然后用流式细胞仪检测细胞凋亡情

    况, 并行细胞周期分析, 分析用CELLQ uest 软件进

    行数据获取和细胞凋亡分析, 用ModiF it 软件分析

    细胞周期 ......