通络方剂抑制炎症、保护内皮、稳定斑块、抗心律失常机制研究进展
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中华医学会第九次全国心血管病学术会议报道
心律失常发生机制与治疗(2)
—— 参松养心胶囊心电生理学研究
北京阜外心血管病医院病理与生理实验中心 浦介麟 李宁 等
方法
1. 单个豚鼠心肌细胞分离
研究者将参考文献加以改进，用急性酶解法制备心室肌单个细胞。研究者将豚鼠用50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开胸取其心脏，在4℃无钙Tyrode液中去除脂肪和心包膜，分离主动脉并插管，行Langendorff心脏灌流(速度为6～8 ml/min)；先以无钙台氏液灌流3 min(灌注压为20 cm水柱)，洗净冠脉内血液，再用低钙酶解液(CaCl2 为0.1 mmol/L低钙台氏液, 含Ⅱ型胶原酶0.4 mg /ml，蛋白酶E 0.04 mg /ml)循环灌流；15～20 min后，将心脏从Langendorff装置上取下，置入室温KB液中，剪去心房和基底部的组织，持眼科镊将心室组织轻轻撕拉，用粗开口吸管缓慢吹打，使心肌细胞从心肌组织上脱离，获得单个心室肌细胞；上清液用120目的过滤网过滤，心肌细胞收藏在含KB液的试管中。整个灌流系统温度保持在37℃，所有灌流液和KB液均通以100 %的O2，氧饱和30 min以上，将细胞在室温下静置1h左右复钙至0.25 mmol/L，室温保存备用。
2. 全细胞膜片钳实验记录
研究者在实验前吸取少许富含细胞的KB悬液置于0.5 ml的灌流槽中，静置5～10 min，待细胞沉底附壁后，用100% O2饱和的细胞外液进行表面灌流5～10 min，流速2～3 ml/min；在倒置显微镜(OLYMPUS IX70)下选择边缘清楚、表面光滑、横纹清晰、无收缩的细胞，在22～24℃室温下进行实验；采用Hamill 等人的标准全细胞膜片钳记录方法，在电压钳制模式下记录通道电流。膜片钳放大器(Axopatch 200B，美国Axon公司)，通过A/D和D/A数据转换器(Digidata 1200，美国Axon公司)同计算机相连接。刺激信号及电压、电流输入信号的采集均由软件(pClampex 7.0，美国Axon公司)控制。玻璃毛胚管(中国科学院物理所提供)经微电极拉制仪(p-97，美国sutter公司)由4步拉制而成，经抛光仪(MF-830，日本NARISHIGE公司)抛光后尖端直径为2～3 μm。充灌电极内液后入水电阻为1～2 MΩ，将补偿液接电位后，研究者调节三维操纵器(MHW-3，日本NARISHIGE公司)使电极尖端移向细胞表面，形成高阻封接(giga seal)，封接电阻为1 GΩ以上；补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式；进行电容测定时给予-10 mV阶跃刺激，用Cm=τ·Iss/△V求膜电容；调节慢电容补偿和串联电阻补偿80%～90%以减少瞬时充放电电流和钳位误差。信号经截止频率为1 kHz的四阶贝塞尔低通滤波器，采样率为10 kHz。
在记录时，为避免电流衰减(run down)现象的影响，应在电极内液中加入ATP，并控制实验操作在细胞破膜后25 min内完成。根据实验设计，研究者将配制好的不同浓度的药物溶液，用恒流蠕动泵以2 ml/min的速度向细胞灌流槽分别灌流，同时使用整负压吸引装置将废液从灌流槽吸除。记录方法为破膜后稳定5 min记录给药前的电流值，给药5 min后分别记录不同浓度药物作用下的电流值。采样后数据存贮在电脑硬盘内，供测量及分析用。为消除细胞间误差，电流值以电流密度(PA/PF)表示。
3. 各电流刺激方案设定及观察指标
记录INa时刺激方案
维持电位(Vh)-100 mV，指令电位-100 mV~+40 mV, 阶跃10 mV, 钳制时间 30 ms, 刺激频率0.2 Hz; 以测试电压-20 mV 的 INa 峰值电流密度在用药前后的变化作为观察指标。
记录 ICa 时刺激方案
维持电位 (Vh)-70 mV，指令电位-60 mV~+60 mV, 阶跃10 mV, 钳制时间240 ms, 刺激频率0.2 Hz; 以测试电压10 mV的ICa 峰值电流密度在用药前后的变化作为观察指标。
研究者为避免长时间记录时Run down 现象对实验结果的影响，故设立空白对照组, 即相同条件下引出INa、ICa L 后以不含药物的细胞外液灌流, 每5 min 重复实验一次, 仍以INa和 ICa L最大峰值电流(INa max和ICa L max )作为观察指标。
数据分析与统计
研究者对原始电流数据采用 Clampfit 8.0(美国 Axon 公司)进行测量采集，使用Origin 6.0数据处理软件(美国 Microcal Software 公司)对采集后数据进行分析、拟合及作图。实验数据以均数±标准差(χ2±S)表示，给药前后采用配对 t 检验，P<0.05认为有显著性差异。
结果
1. 参松养心胶囊对豚鼠心肌细胞膜INa的作用
研究者使用 INa 细胞内外液和刺激方案，在豚鼠心室肌细胞上能记录到一快速激活、快速失活的内向电流。膜电位从-50 mV 开始激活，峰值电位在-20 mV 左右，反转电位+20 mV 左右。