心肌肌钙蛋白Ｉ的临床应用进展 .doc
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心肌肌钙蛋白I的临床应用进展
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是一项新的心肌损伤的特异性和敏感性指标。1987年英国Cummins[1]等首先报告了采用测定外周血中心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)浓度来诊断AMI，引起了研究者们的广泛注意。近年来关于心肌肌钙蛋白的研究初步表明， cTnI是心脏的特异性抗原，其释放入血循环是心肌细胞损伤的敏感和高度特异的标志，对某些心血管病的诊断、预后及疗效判断等具有重要意义[2-4]。1995年美国FDA批准cTnI作为AMI的最新实验诊断指标。与其它指标相比，cTnI在血中出现早、持续时间长，且为心肌细胞所特有，因此对AMI评价敏感性高、特异性强，还可用于对心脏手术的心肌保护、心肌损伤进行评价以及对AMI、心脏手术的术后监护、预后及疗效判断。cTnI在临床上有着广泛的应用前景。
一、心肌肌钙蛋白I理化性质
肌细胞内的收缩蛋白主要有肌凝蛋白、原肌凝蛋白、肌动蛋白及肌钙蛋白。肌钙蛋白是由T、I和C 3个亚单位组成的复合体，肌钙蛋白I(troponin I，TnI)是该复合体中起调节作用的单链多肽。TnI有3种同型形式，其中2种存在于骨骼肌纤维中，一种存在于心肌纤维中，即cTnI[5]。cTnI为心肌肌钙蛋白(cTn)的三个亚单位(cTnI，cTnC和cTnT)之一，是肌肉组织收缩的调节蛋白，本身是多肽，位于收缩蛋白的细肌丝上，在肌肉收缩和舒张过程中起着重要的调节作用。cTnI分子量为22500，它在基因上有着独一无二的序列[6]，cTnI多肽N末端比骨骼肌TnI多出26个氨基酸，两者间的氨基酸序列差异达40%，因而抗原性与骨骼肌明显不同[7]。cTnI以两种形式存在于心肌细胞内，即小部分游离于胞浆中，为可溶性，大部分以结构蛋白形式固定于肌原纤维上，为不可溶性。当肌浆中Ca2+浓度降低时，cTnI与肌动蛋白(A)及可能还有原肌凝蛋白(Tm)上的位点结合，将Tm锁于阻断位置，从而阻止肌凝蛋白(M)与A相互作用，于是肌肉舒张。在激活状态下，Ca2+从肌浆网释出，与cTnC结合，解除了cTnI与A-Tm之间的结合，cTnI的抑制作用被取消，Tm与cTnT结合，使得Tm移动至非阻断位置，导致M与A相互作用，粗细肌丝互相滑动，肌肉收缩[6,8]。
不同组织来源的TnI有组织特异性而无种属特异性。cTnI仅存在于心房肌和心室肌中，且只有一种TnI存在，胎儿、新生儿及成年等各阶段的cTnI均相同。所以cTnI是一种理想的心肌细胞特异性标志。心肌细胞胞浆内游离cTnI只占4.1%，大部分cTnI与肌钙蛋白T及C亚单位结合在一起，以复合体的形式存在[9]。在心肌细胞膜完整的情况下，cTnI不能透出细胞膜进入血循环。当细胞膜的完整性因缺血、缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流；而结合的cTnI由于相对分子质量大，延迟透出胞膜入血，并逐渐分解出cTnI [3]，由于cTnI分子量较小并持续从变性细胞内逸出，故AMI发生后，在血中出现较早，并持续相当长时间[10]，这一特点有利于AMI的早期诊断和晚期诊断。
二、心肌肌钙蛋白I在心肌损伤时的特异性与敏感性及其动态变化
由于cTnI只存在于心肌组织中，在心肌损伤患者检测cTnI时，不受其它脏器损伤所干扰，因而cTnI具有良好的特异性[5]。与其它血清酶相比，cTnI是心肌损伤时更具有特异性的标记物，同时它敏感性也很高，可以诊断心脏手术(例如：钙化性主动脉瓣狭窄和冠状动脉旁路手术)周围的微小梗死和缺血出现4小时的AMI。cTnI在正常人血循环中含量极少，主要存在于心肌细胞内，干质量为CK-MB的13.3倍[11]，心肌细胞损伤时血中cTnI变化幅度大，因而cTnI敏感性较高。根据Emmanuwlle Vermes [12]及国内肖苍松[13]等报道，心脏直视术后即刻cTnI开始升高，8～12小时达到峰值，术后7天后降至正常。另据Admas[2]报道，当心肌损伤时，游离于胞浆内的cTnI快速释放进入血循环，血清cTnI水平于3～5小时升高，其后肌原纤维不断崩解破坏，cTnI不断释出，血清水平于24小时达高峰，5～10天后降至正常。胡春波[14]等认为人群中心肌损伤后cTnI6小时达到高峰，持续升高4～7天，所以它不仅用于单纯诊断AMI，而且还具有更大的价值，即患者在出现胸痛症状前几天的微小心肌损伤，可以用cTnI检测出来。根据国外文献报道，正常人cTnI 含量极低，如cTnI>0.15μg/L ，对心肌损伤就有诊断意义[15]。Larue[3]等用IEMA (immunoenzymometric assay)观察了cTnI在AMI早期的变化，27例经过溶栓治疗的AMI患者，在胸痛发作4.3±2.1小时即可发现cTnI升高，峰值在12.2±4.6小时出现，平均峰值为41±59μg/L(1.2～278μg/L)，其中21例患者cTnI在胸痛发作后117±46小时消失，其它6例在出院后仍可检出cTnI。16例非溶栓治疗AMI患者在胸痛发作4.6±1.6小时即可检出cTnI，与溶栓治疗组无显著性差异，其峰值在AMI发作后16±6小时，在血中出现明显迟于溶栓治疗组，其峰值为21±26μg/L (0.6～66μg/L)，两组cTnI峰值无显著性差异。非溶栓治疗组cTnI在发作后166±62小时消失，显著迟于溶栓治疗组。血清cTnI水平是诊断AMI敏感而特异的指标。Mair[9]等的临床观察显示AMI患者血清cTnI开始出现的时间是发病后0.5～8 小时，中位数为3.5 h；峰值出现于9～16.5 h，中位数为12 h；持续至少4 天，第7天敏感度仍为0.7。cTnI诊断AMI的敏感度与CK-MB接近，但CK-MB在胸痛3 天后多迅速降至正常，而cTnI下降缓慢，有些患者在AMI后6～8 天仍高于正常水平，这就为临床上48～72 小时后才入院的AMI患者的诊断提供了依据。Adams[2]等研究表明，90%慢性心肌病、59%的骨骼肌损伤和3.8%肾衰患者有CK-MB升高，而能检出cTnI的6例患者中，有4例超声心动图显示局限性室壁活动异常，1例Duchenne肌营养不良，1例ECG出现新的Q波。说明除非同时合并心肌损伤，仅有骨骼肌损伤不会引起cTnI升高，单纯的肾衰也不会导致cTnI异常，cTnI是目前发现评价心肌损伤特异性最高的生化指标。
三 、心肌肌钙蛋白I的检测
目前报道的cTnI测定方法主要有2大类：一类是放免法(radio immunoassay，RIA)，一类是酶联免疫吸附分析法(enzyme-link immunoassay, ELISA)及其衍生方法等。
(一)放射免疫法(RIA) 血中cTnI的RIA测定法首先由Cummins[7]等于1987年建立的沉淀双抗体竞争放免法，抗体是兔抗人cTnI多克隆抗体。其原理是：先将待测血清和一定量的兔抗人cTnI抗体混合孵育，然后再加入一定量125I标记的cTnI。于是，125I标记的cTnI与待测血清中的cTnI竞争性地和抗cTnI抗体结合，形成抗原抗体复合物。再在其中加入猴抗兔IgG时，IgG与抗原抗体复合物结合形成沉淀。离心去上清，测定沉淀的放射强度，与标准曲线对照，就可得到待测血清中cTnI的含量。此法灵敏度差，测定低限为10 μg/L。由于使用多克隆抗体测定，交叉反应多，在骨骼肌TnI质量浓度为20 mg/L时，交叉反应达25%；且技术复杂，耗时长，一般需要2～4 d，因而不适合于临床。应用该法测定需时间较长，检测敏感度也较低(10μg/L)，亦不适用于AMI的早期诊断及微小梗死的诊断。1992年国内唐新等率先用亲和层析法分离人心脏特异性肌钙蛋白I获得成功，继之用免疫新西兰纯系兔而获得特异性抗血清，经Iodigen法制备碘125-cTnI，建立了cTnI双抗体RIA，使测定灵敏度达1.5μg/L[16]。
(二) 用单克隆抗体测定cTnI的ELISA法
Bordor[17]等于1992年报道了使用两种单克隆抗体测定cTnI的双夹心ELISA法(简称Bordor法)，该法测定时间为3.5小时，检测灵敏度1.9μg/L，变异系数(CV)为10%～20%，工作曲线范围为0～100μg/L，无交叉反应。该法耗时较短，灵敏度也较高，但用于对AMI的诊断仍嫌耗时过长。Bordor等从8种纯化的单克隆抗体中筛选出一对能同时与cTnI结合，并且亲合力强的抗体用于免疫分析。具体方法是：用一种单克隆抗体包被微滴定盘，将另一种抗体用碱性磷酸酶标记。于微滴定盘中加入待测血清或标准cTnI，孵育、冲洗；再加入碱性磷酸酶标记的抗体，孵育、冲洗，待测血清中的cTnI或标准cTnI便将一定量的碱性磷酸酶连接到微滴定盘上；然后加底物显色，分光光度计比色，就可测出待测血清中cTnI的含量。1993年Larue[3]等对Bordor法进一步改进。从28种纯化单克隆抗体中筛选出一对特异性和亲合力更强的抗体用于免疫分析，并用HRP取代碱性磷酸酶，从而使测定最低质量浓度降至0.1～0.2 μg/L，测定时间减至30 分钟。因而，此法是较理想的cTnI测定方法(简称Larue法)。这一方法的建立推动了cTnI测定在临床应用中的研究。
(三) 其它方法
酶免疫化学发光测定法(CLIA) 是法国巴斯德公司首先建立该法，整个测定仅需20分钟，因此非常适合急诊对AMI的诊断。该法的灵敏度为0.01μg/L，CV<6.4%，参考范围上限为0.3μg/L，诊断AMI的界值(cutoff值)0.33μg/L[18]。国内目前华山医院等为数不多的几家医院检验科已能开展。
免疫色谱干膜层析活性卡法[19]采用芬兰安力生物科技有限公司提供的TnI活性卡，抽取静脉血1 ml，肝素抗凝，用微量管向试验卡内分别滴入150 µ l全血(也可用血浆、血清)，15 分钟内观察结果。检测区内显示两条线为阳性?
心肌肌钙蛋白I的临床应用进展
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是一项新的心肌损伤的特异性和敏感性指标。1987年英国Cummins[1]等首先报告了采用测定外周血中心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)浓度来诊断AMI，引起了研究者们的广泛注意。近年来关于心肌肌钙蛋白的研究初步表明， cTnI是心脏的特异性抗原，其释放入血循环是心肌细胞损伤的敏感和高度特异的标志，对某些心血管病的诊断、预后及疗效判断等具有重要意义[2-4]。1995年美国FDA批准cTnI作为AMI的最新实验诊断指标。与其它指标相比，cTnI在血中出现早、持续时间长，且为心肌细胞所特有，因此对AMI评价敏感性高、特异性强，还可用于对心脏手术的心肌保护、心肌损伤进行评价以及对AMI、心脏手术的术后监护、预后及疗效判断。cTnI在临床上有着广泛的应用前景。
一、心肌肌钙蛋白I理化性质
肌细胞内的收缩蛋白主要有肌凝蛋白、原肌凝蛋白、肌动蛋白及肌钙蛋白。肌钙蛋白是由T、I和C 3个亚单位组成的复合体，肌钙蛋白I(troponin I，TnI)是该复合体中起调节作用的单链多肽。TnI有3种同型形式，其中2种存在于骨骼肌纤维中，一种存在于心肌纤维中，即cTnI[5]。cTnI为心肌肌钙蛋白(cTn)的三个亚单位(cTnI，cTnC和cTnT)之一，是肌肉组织收缩的调节蛋白，本身是多肽，位于收缩蛋白的细肌丝上，在肌肉收缩和舒张过程中起着重要的调节作用。cTnI分子量为22500，它在基因上有着独一无二的序列[6]，cTnI多肽N末端比骨骼肌TnI多出26个氨基酸，两者间的氨基酸序列差异达40%，因而抗原性与骨骼肌明显不同[7]。cTnI以两种形式存在于心肌细胞内，即小部分游离于胞浆中，为可溶性，大部分以结构蛋白形式固定于肌原纤维上，为不可溶性。当肌浆中Ca2+浓度降低时，cTnI与肌动蛋白(A)及可能还有原肌凝蛋白(Tm)上的位点结合，将Tm锁于阻断位置，从而阻止肌凝蛋白(M)与A相互作用，于是肌肉舒张。在激活状态下，Ca2+从肌浆网释出，与cTnC结合，解除了cTnI与A-Tm之间的结合，cTnI的抑制作用被取消，Tm与cTnT结合，使得Tm移动至非阻断位置，导致M与A相互作用，粗细肌丝互相滑动，肌肉收缩[6,8]。
不同组织来源的TnI有组织特异性而无种属特异性。cTnI仅存在于心房肌和心室肌中，且只有一种TnI存在，胎儿、新生儿及成年等各阶段的cTnI均相同。所以cTnI是一种理想的心肌细胞特异性标志。心肌细胞胞浆内游离cTnI只占4.1%，大部分cTnI与肌钙蛋白T及C亚单位结合在一起，以复合体的形式存在[9]。在心肌细胞膜完整的情况下，cTnI不能透出细胞膜进入血循环。当细胞膜的完整性因缺血、缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流；而结合的cTnI由于相对分子质量大，延迟透出胞膜入血，并逐渐分解出cTnI [3]，由于cTnI分子量较小并持续从变性细胞内逸出，故AMI发生后，在血中出现较早，并持续相当长时间[10]，这一特点有利于AMI的早期诊断和晚期诊断。
二、心肌肌钙蛋白I在心肌损伤时的特异性与敏感性及其动态变化
由于cTnI只存在于心肌组织中，在心肌损伤患者检测cTnI时，不受其它脏器损伤所干扰，因而cTnI具有良好的特异性[5]。与其它血清酶相比，cTnI是心肌损伤时更具有特异性的标记物，同时它敏感性也很高，可以诊断心脏手术(例如：钙化性主动脉瓣狭窄和冠状动脉旁路手术)周围的微小梗死和缺血出现4小时的AMI。cTnI在正常人血循环中含量极少，主要存在于心肌细胞内，干质量为CK-MB的13.3倍[11]，心肌细胞损伤时血中cTnI变化幅度大，因而cTnI敏感性较高。根据Emmanuwlle Vermes [12]及国内肖苍松[13]等报道，心脏直视术后即刻cTnI开始升高，8～12小时达到峰值，术后7天后降至正常。另据Admas[2]报道，当心肌损伤时，游离于胞浆内的cTnI快速释放进入血循环，血清cTnI水平于3～5小时升高，其后肌原纤维不断崩解破坏，cTnI不断释出，血清水平于24小时达高峰，5～10天后降至正常。胡春波[14]等认为人群中心肌损伤后cTnI6小时达到高峰，持续升高4～7天，所以它不仅用于单纯诊断AMI，而且还具有更大的价值，即患者在出现胸痛症状前几天的微小心肌损伤，可以用cTnI检测出来。根据国外文献报道，正常人cTnI 含量极低，如cTnI>0.15μg/L ，对心肌损伤就有诊断意义[15]。Larue[3]等用IEMA (immunoenzymometric assay)观察了cTnI在AMI早期的变化，27例经过溶栓治疗的AMI患者，在胸痛发作4.3±2.1小时即可发现cTnI升高，峰值在12.2±4.6小时出现，平均峰值为41±59μg/L(1.2～278μg/L)，其中21例患者cTnI在胸痛发作后117±46小时消失，其它6例在出院后仍可检出cTnI。16例非溶栓治疗AMI患者在胸痛发作4.6±1.6小时即可检出cTnI，与溶栓治疗组无显著性差异，其峰值在AMI发作后16±6小时，在血中出现明显迟于溶栓治疗组，其峰值为21±26μg/L (0.6～66μg/L)，两组cTnI峰值无显著性差异。非溶栓治疗组cTnI在发作后166±62小时消失，显著迟于溶栓治疗组。血清cTnI水平是诊断AMI敏感而特异的指标。Mair[9]等的临床观察显示AMI患者血清cTnI开始出现的时间是发病后0.5～8 小时，中位数为3.5 h；峰值出现于9～16.5 h，中位数为12 h；持续至少4 天，第7天敏感度仍为0.7。cTnI诊断AMI的敏感度与CK-MB接近，但CK-MB在胸痛3 天后多迅速降至正常，而cTnI下降缓慢，有些患者在AMI后6～8 天仍高于正常水平，这就为临床上48～72 小时后才入院的AMI患者的诊断提供了依据。Adams[2]等研究表明，90%慢性心肌病、59%的骨骼肌损伤和3.8%肾衰患者有CK-MB升高，而能检出cTnI的6例患者中，有4例超声心动图显示局限性室壁活动异常，1例Duchenne肌营养不良，1例ECG出现新的Q波。说明除非同时合并心肌损伤，仅有骨骼肌损伤不会引起cTnI升高，单纯的肾衰也不会导致cTnI异常，cTnI是目前发现评价心肌损伤特异性最高的生化指标。
三 、心肌肌钙蛋白I的检测
目前报道的cTnI测定方法主要有2大类：一类是放免法(radio immunoassay，RIA)，一类是酶联免疫吸附分析法(enzyme-link immunoassay, ELISA)及其衍生方法等。
(一)放射免疫法(RIA) 血中cTnI的RIA测定法首先由Cummins[7]等于1987年建立的沉淀双抗体竞争放免法，抗体是兔抗人cTnI多克隆抗体。其原理是：先将待测血清和一定量的兔抗人cTnI抗体混合孵育，然后再加入一定量125I标记的cTnI。于是，125I标记的cTnI与待测血清中的cTnI竞争性地和抗cTnI抗体结合，形成抗原抗体复合物。再在其中加入猴抗兔IgG时，IgG与抗原抗体复合物结合形成沉淀。离心去上清，测定沉淀的放射强度，与标准曲线对照，就可得到待测血清中cTnI的含量。此法灵敏度差，测定低限为10 μg/L。由于使用多克隆抗体测定，交叉反应多，在骨骼肌TnI质量浓度为20 mg/L时，交叉反应达25%；且技术复杂，耗时长，一般需要2～4 d，因而不适合于临床。应用该法测定需时间较长，检测敏感度也较低(10μg/L)，亦不适用于AMI的早期诊断及微小梗死的诊断。1992年国内唐新等率先用亲和层析法分离人心脏特异性肌钙蛋白I获得成功，继之用免疫新西兰纯系兔而获得特异性抗血清，经Iodigen法制备碘125-cTnI，建立了cTnI双抗体RIA，使测定灵敏度达1.5μg/L[16]。
(二) 用单克隆抗体测定cTnI的ELISA法
Bordor[17]等于1992年报道了使用两种单克隆抗体测定cTnI的双夹心ELISA法(简称Bordor法)，该法测定时间为3.5小时，检测灵敏度1.9μg/L，变异系数(CV)为10%～20%，工作曲线范围为0～100μg/L，无交叉反应。该法耗时较短，灵敏度也较高，但用于对AMI的诊断仍嫌耗时过长。Bordor等从8种纯化的单克隆抗体中筛选出一对能同时与cTnI结合，并且亲合力强的抗体用于免疫分析。具体方法是：用一种单克隆抗体包被微滴定盘，将另一种抗体用碱性磷酸酶标记。于微滴定盘中加入待测血清或标准cTnI，孵育、冲洗；再加入碱性磷酸酶标记的抗体，孵育、冲洗，待测血清中的cTnI或标准cTnI便将一定量的碱性磷酸酶连接到微滴定盘上；然后加底物显色，分光光度计比色，就可测出待测血清中cTnI的含量。1993年Larue[3]等对Bordor法进一步改进。从28种纯化单克隆抗体中筛选出一对特异性和亲合力更强的抗体用于免疫分析，并用HRP取代碱性磷酸酶，从而使测定最低质量浓度降至0.1～0.2 μg/L，测定时间减至30 分钟。因而，此法是较理想的cTnI测定方法(简称Larue法)。这一方法的建立推动了cTnI测定在临床应用中的研究。
(三) 其它方法
酶免疫化学发光测定法(CLIA) 是法国巴斯德公司首先建立该法，整个测定仅需20分钟，因此非常适合急诊对AMI的诊断。该法的灵敏度为0.01μg/L，CV<6.4%，参考范围上限为0.3μg/L，诊断AMI的界值(cutoff值)0.33μg/L[18]。国内目前华山医院等为数不多的几家医院检验科已能开展。
免疫色谱干膜层析活性卡法[19]采用芬兰安力生物科技有限公司提供的TnI活性卡，抽取静脉血1 ml，肝素抗凝，用微量管向试验卡内分别滴入150 µ l全血(也可用血浆、血清)，15 分钟内观察结果。检测区内显示两条线为阳性?
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