A 基础部分 · 3 ·

    A-1 雷帕霉素对高糖诱导肾小球系膜细胞增殖

    的影响

    中南大学肾脏病研究所 中南大学湘雅二医院肾病内科

    解放军总医院肾病内科 全军肾脏病研究所暨重点实验室

    卓 莉 刘伏友 傅 博 张四方

    陈俊香 蔡广研 陈香美

    目的 探讨雷帕霉素对高糖诱导肾小球系膜细胞增殖

    的影响及其可能涉及的途径。方法 高糖培养系膜细胞，不同剂量雷帕霉素干预，MTT及流式细胞仪等方法观察雷

    帕霉素对细胞增殖和周期的影响，RT-PCR、Western 印迹

    观察细胞Cyclin D1、CyclinE和p27KIP1

    的变化。结果 高

    糖刺激下，系膜细胞增殖明显，雷帕霉素能抑制这一作用，且呈剂量依赖性；并下调了Cyclin D1、CyclinE的基因及

    蛋白水平，上调p27KIP1

    的蛋白表达；流式细胞仪检测结果

    显示与对照组相比，高糖组 G0/ G1期细胞减少(高糖组比

    对照组为：61.8±0.002% 83.8±0.017%) ，S期细胞比例增

    加(26.2±0.022%比 0.2±0.004%)(P<0.05) ；雷帕霉素

    干预后，G0/G1 期细胞升高(高糖组比三个浓度雷帕霉素

    组分别为：61.8±0.017%比 63.3±0.034%比 69.5±0.013%

    比 73.3±0.001%) ，S 期细胞比例减少(26.2±0.022%比

    19.0±0.027%比12.0±0.016%比9.6±0.009%)(P<0.05) 。

    结论 雷帕霉素可以抑制高糖状态下系膜细胞的增殖，且

    呈剂量依赖性； 其可能机制是通过下调Cyclin D1、 CyclinE

    及上调p27KIP1

    ，参与了G1/S期阻滞。

    A-2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在大鼠肾脏组织

    表达的增龄性变化及意义

    中南大学肾脏病研究所 中南大学湘雅二医院肾病内科

    解放军总医院肾病内科 全军肾脏病研究所暨重点实验室

    卓 莉 蔡广研 刘伏友 陈俊香

    张四方 彭佑铭 刘维萍 陈香美

    目的 研究大鼠肾脏哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

    (mTOR)随增龄的表达变化规律并探讨其在肾脏衰老中

    的意义。方法 选取3月龄、12月龄及24月龄正常大鼠，采用RT-PCR、Western印迹及免疫组化等方法分别在基因

    及蛋白质表达水平上检测肾脏mTOR及p-mTOR的表达变

    化。 结果 大鼠mTOR mRNA表达呈现随增龄表达逐渐增

    强的趋势(P<0.05) 。Western印迹显示mTOR及p-mTOR

    蛋白表达随鼠龄增加逐渐增强的趋势(P<0.05) 。免疫组

    化结果显示mTOR蛋白表达于大鼠肾小球系膜区，其在肾

    小管-间质也有表达，且随增龄，它与 FN 的表达及增龄所

    致的肾脏病变皆有显著相关性。结论 mTOR 在大鼠肾组

    织表达随龄增加，与增龄所致的肾脏病变有显著相关性，可能参与肾脏衰老的进程。

    A-3 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在大鼠肾小球系

    膜细胞中随龄变化的研究

    中南大学肾脏病研究所 中南大学湘雅二医院肾病内科

    解放军总医院肾病内科 全军肾脏病研究所暨重点实验室

    卓 莉 蔡广研 刘伏友 陈俊香

    张四方 彭佑铭 刘维萍 陈香美

    目的 研究大鼠肾脏哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

    (mTOR) 在大鼠系膜细胞中随龄表达变化规律。 方法 选

    取 3 月龄、12 月龄及 24 月龄正常大鼠，分别取原代系膜

    细胞做衰老表型的分析(SA-β-gal染色) ，采用RT-PCR和

    Western 印迹法分别在基因及蛋白质表达水平上检测肾小

    球系膜细胞中mTOR及p-mTOR 的表达变化， 并用荧光法

    分别检测 mTOR在肾小球系膜细胞中的表达与定位。结果

    随年龄增长，大鼠肾小球系膜细胞SA-β-gal染色阳性率逐

    步增加；mTOR mRNA表达呈现随增龄表达逐渐增强的趋

    势(P<0.05) 。Western 印迹亦显示 mTOR 及 p-mTOR 蛋

    白表达随鼠龄增加逐渐增强的趋势(P<0.05) 。免疫荧光

    结果显示mTOR在大鼠系膜细胞胞浆及胞核内皆有表达，随着年龄增长表达的荧光强度逐渐上升(P<0.05) 。结论

    mTOR 在大鼠肾小球系膜细胞中的表达随龄增加，其可能

    参与了肾小球系膜细胞衰老的进程。

    A-4 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白促进细胞衰老的

    作用机制

    中南大学肾脏病研究所 中南大学湘雅二医院肾病内科

    解放军总医院肾病内科 全军肾脏病研究所暨重点实验室

    卓 莉 蔡广研 刘伏友 陈俊香

    张四方 彭佑铭 刘维萍 陈香美

    目的 研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在细

    胞衰老过程中的作用机制。方法 应用mTOR的激动剂和

    抑制剂分别干预 WI-38 细胞，检测衰老的相关指标，包括

    衰老相关SA-β-gal染色阳性率，流式细胞仪检测了细胞周

    期的变化及细胞大小，计数细胞分裂代数；并利用激光共

    聚焦技术观察 mTOR 与 p21WAF1/CIP1/SDI1

    之间的关系。结果

    mTOR的激动剂能上调P21WAF1/CIP1/SDI1

    及Cyclin D1基因及

    蛋白质的表达，引起细胞周期阻滞，促进细胞肥大，缩短

    细胞的传代次数；mTOR 的抑制剂能下调 P21WAF1/CIP1/SDI1

    及 Cyclin D1 基因及蛋白质的表达，减慢细胞生长及分化

    速度，缩小细胞体积，延长细胞的传代次数。结论 mTOR

    能促进蛋白质合成，致使细胞肥大；并且通过对

    P21WAF1/CIP1/SDI1

    的调节，参与G1期细胞周期阻滞，调控细

    胞衰老的进程。

    · 4 ·

    A-5 抑制 mTOR 通过 SIRT1 途径延缓系膜细胞

    复制性衰老

    中南大学肾脏病研究所 中南大学湘雅二医院肾内科

    解放军总医院肾科 全军肾脏病研究所暨肾病重点实验室

    张四方 蔡广研 傅 博 谢院生 刘伏友 陈香美

    目的 能量代谢失衡与衰老密切相关，也是目前衰老

    研究的热点。在哺育动物中限制热量主要通过SIRT1途径

    影响衰老。 mTOR是一类进化上非常保守的蛋白激酶家族，是控制细胞生长与增殖的中心环节。mTOR 与细胞能量代

    谢密切相关。在低等生物中部分抑制TOR功能，能导致这

    些有机体生存期延长， 抑制TOR延缓衰老的作用机制与限

    制热量相似。研究表明mTOR 的活化与糖尿病肾病、梗阻

    性肾病肾脏肥大密切相关，抑制mTOR 能够抑制肾小球系

    膜细胞增殖及肥大和细胞外基质的产生，改善肾间质纤维

    化，提示mTOR与衰老相关肾脏纤维化密切相关，并可能

    参与了肾小球系膜细胞衰老。另有研究显示，SIRT1 在肾

    脏系膜细胞的凋亡及肾小球疾病过程中也起重要作用，是

    肾脏的一种保护因子。本研究以能量代谢为切入点，观察

    mTOR 和 SIRT1 在系膜细胞复制性衰老过程中的表达变

    化，并进一步深入研究抑制mTOR后对系膜细胞复制性衰

    老及SIRT1的表达与活性的影响， 探讨mTOR在肾脏器官

    衰老进程的作用及可能的作用机制。方法 取 3 月龄大鼠

    原代系膜细胞，检测系膜细胞在体外传代过程中与衰老相

    关的 β-gal染色、细胞周期和大小、周期负调蛋白(P21、P27 及 P53) 、mTOR 和 SIRT1 的 mRNA 和蛋白表达随代

    龄增加的变化；比较对照组与不同浓度rapamycin组12代

    龄细胞的增殖能力、衰老相关的 β-gal染色的阳性细胞数、细胞周期和大小、周期负调蛋白(P21、P27 及 P53)及

    P-mTOR 和 SIRT1 蛋白表达水平 ......