肿瘤分子诊断学.ppt
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参见附件(321KB)。
本章主要内容
一、分子诊断概述
二、肿瘤的分子诊断
三、分子诊断在肿瘤研究中的应用
四、分子诊断发展前景及存在的问题
分子诊断
(molecular diagnosis)
概念：一种疾病的发生常伴有相关
基因变化，分子诊断是在分
子水平上研究和探索疾病发
生的分子基础的方法。
分子诊断的特点：
灵敏度高
特异性强
适用范围广
取材一般不受组织或时相限制
分子诊断目前主要应用于
人类遗传病的基因诊断和产前诊断
肿瘤
感染性疾病病原体(细菌、病毒)
多基因病
组织器官移植配型
性别鉴定
法医学
医学分子生物学基础研究应用
肿瘤的分子诊断
与肿瘤相关的基因
* 癌基因
* 抑癌基因
* DNA错配修复基因
癌基因：是存在于致瘤病毒、人和动物细
胞中能导致细胞恶性转化，促进
细胞生长和增殖的一类基因。
Ras C-Met
Myc Mdm2
Neu Bcl-2
抑癌基因：是正常细胞内存在的能够抑制细胞恶性转化，对正常细胞的增殖起负性调节作用的基因，抑癌基因失活后正常细胞增殖失控，转化形
成肿瘤细胞。
RbPTENAPC MCCVHL
P53FHITWTIDPC4
P16BRCANF1NF2 nm23
P15DCCHNPCC
肿瘤分子诊断的基础
-基因改变
点突变
指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能。
点突变
基因扩增
是细胞原癌基因在细胞基因组内拷贝数的增加及其表达水平的增高。
* 基因扩增是由于基因DNA的过度复制所致，常引起细胞核型改变，表现为出现无着丝点的双微粒体(DMs)和缺乏正常明暗交替染色带的均匀染色区(HSRs)。
基因扩增
基因缺失
基因片段的缺失是另一种主要的基因变异形式，，缺失的范围差别较大，可以是1-2个碱基，也可以是一个片段或一个外显子的缺失。
* 杂合型缺失
* 杂合型缺失
* 正常组织杂合状态下等位基因有两条电泳带，当肿瘤组织等位DNA两条带中的一条较正常等位基因带明显减弱(>70%)则认定为LOH(图1)。
基因易位、重排
某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置上称为易位或重排。
基因易位、重排
* 在一些肿瘤中可以见到异常的染色体，有的长些，有的短些。通过基因部分定位研究，证明在这些异常的染色体中发生了某些基因的易位和重排。
* 由于基因基因的易位和重排，原来无活性的原癌基因被移到某些强的启动基因或增强子附近而被活化，以致原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。
基因易位、重排
DNA多态性
群体中的不同个体或同一个体的不同染色体DNA核苷酸序列存在许多差异，尤其是非编码区域，大约每几百个碱基中就有一个存在着碱基取代或碱基替代现象，但表型并未改变，这种现象称为DNA多态性。实际上是染色体DNA中核苷酸排列顺序的改变。
DNA多态性
* RFLP
* VNTR
* 小卫星DNA多态
* 微卫星DNA多态
* 单核苷酸多态
RFLP
数量可变的串联重复序列
variable number of tandem repeat, VNTR
人类基因组中含有一些重复序列家族，有些序列分散在基因组中，有些是以一系列短的重复序列排列组成高变区，其串联重复序列拷贝数可相差很多，约占单倍体DNA的10%，基本上位于非编码区。重复单位以6~70bp为多，重复次数约6~100次，称为数量可变的串联重复序列。
RFLP
限制性片段长度多态性
(restriction fragment length polymorphism)
当DNA序列的差异发生在限制性内切酶识
别位点或当DNA片段的插入、缺失或重复可使
基因组DNA经限制性内切酶水解后发生片段长
度改变。因这些特异基因片段是限制性内切酶
产生的，在不同个体间可出现不同长度的限制
性片段类型，故称为限制性片段长度多态性。
小卫星DNA
细胞内基因组含有大量的碱基重复序列，一般将6~70bp的串联重复称为小卫星DNA。
微卫星DNA
将1~4bp的串联重复序列称为微卫星DNA，又称简单重复序列(simple repeat sequence, SRS)。
微卫星不稳定性
microsatelite instability,MI
是指简单重复序列的增加或丢失，特别是在DNA错配修复系统(DNA mismatch system, DNAMMR)缺损的肿瘤基因组中常显示大量的MI。
微卫星不稳定性
MI与癌基因或抑癌基因的变化之间无明显关系，即癌基
因或抑癌基因的突变并不增加微卫星的不稳定性。
MI与肿瘤的发展有关， MI仅在肿瘤细胞中发现，从未在
正常组织中检测到。
在原发与转移性肿瘤中，MI均匀分布于整个肿瘤。在晚期胃癌的MI频率显著高于早期胃癌。
端粒酶与肿瘤的关系及检测
端粒酶与肿瘤
端粒：是位于细胞染色体末端的一种由2~20kb串联的短片段重复
序列(TTAGGG)n及一些结合蛋白组成的特殊结构，在染色
体定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面具有重要作
用， 并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。
端粒酶：为由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物(RNP)，含有端粒重复序列的模板，即以自身RNA组分为模板，复
制合成端粒序列。
目前有关端粒酶活性表达的研究已覆盖了人类大部分的实体瘤。
基因变异及其检测
一、点突变
点突变的检测
* 等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide, ASO)；
* 等位基因特异性扩增法(allele-specific amplification, ASA)；
* 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisim, RFLP)分析；
* DNA测序；
* 基因芯片
一、已知点突变 的检测
点突变的检测
二、未知点突变的检测
* 单链构象多态性(single-strand conformational polymorphisim, SSCP)分析；
* 杂合双链分析法(HA)；
* 变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)；
* 突变体富集PCR法；
* DNA测序；
* 基因芯片
二、基因扩增
基因扩增的检测
-核酸分子杂交
原位杂交分类
基因探针和靶核苷酸不同
* DNA-DNA杂交
* DNA-RNA杂交
* RNA-RNA杂交
探针的标记物是
否能被直接检测
* 直接法
* 间接法
原位分子杂交技术优点
* 特异性强、灵敏度高，具有组织细胞化学染色的可见性
* 既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究
* 所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片
* 应用范围广，可对特定的基因(如癌基因、病毒基因)DNA、mRNA的表达进行定位、定性、定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究
基因扩增的检测
-核酸分子杂交
基因扩增的检测
三、基因缺失、易位与重排
杂合型缺失的检测
基因缺失、易位、重排的检测
四、基因甲基化改变的检测
五、DNA多态性及其检测
DNA多态性
RFLP
MI
Telomere
RFLP
* Southern blot ；
* PCR-RFLP
微卫星不稳定性的检测
基本方法：首先用PCR技术扩增所需的双核苷
酸重复序列，然后用凝胶电泳分析
DNA序列。
优点：比RFLP及其他Southern杂交方法
简易快速；
可对单个细胞进行检测；
可对石蜡包埋的组织进行回顾性研
究，使检测目的更明确。
端粒酶活性的检测
基本方法
TRAP法
接近闪烁分析法
TRAP-ELISA法
原位杂交法
分子诊断在肿瘤研究中的应用
肿瘤的早期诊断
* 胰腺癌：K-Ras基因的第12位编码子突变检出率达100%
* 结肠癌：PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中Ras基因突变率达33.3%
* 高危人群的筛选和临床检测：结肠癌
肿瘤易感基因的检测
已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤
* Rb1(视网膜母细胞瘤)
* WT1(肾母细胞瘤)
* P53(Li-Fraumeni综合征)
* APC(家族性腺瘤性息肉病)
* HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)
* NF1(神经纤维瘤病)
* VHL(Von Hippel-Lindau综合征)
* PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Cowden综合征)
* BRCA1(乳腺癌)
肿瘤的分类
* 限制性酶切片段多态性 (restriction fragment length polymorphism， RFLP)：用于判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源
* Bcr区基因重排：可对慢性粒细胞白血病作出诊断并可与急性粒细胞白血病进行鉴别诊断
* Myc基因检测：通过对N-Myc和C-Myc的扩增和表达检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值
肿瘤的个体化和预见性治疗
基因的变化和基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切关联，如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。
肿瘤的预后判断
* P53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后有关
* Nm23的状态与肿瘤转移有关
肿瘤的预后检测
* 在白血病的临床治疗缓解期的白血病细胞仍达1011。
* 应用细胞遗传学
分子诊断存在的问题
1操作复杂
2结果受多方面因素的影响
(技术性假阳性和假阴性)
3费用昂贵
4局限于研究领域
研究方向
本章主要内容
一、分子诊断概述
二、肿瘤的分子诊断
三、分子诊断在肿瘤研究中的应用
四、分子诊断发展前景及存在的问题
分子诊断
(molecular diagnosis)
概念：一种疾病的发生常伴有相关
基因变化，分子诊断是在分
子水平上研究和探索疾病发
生的分子基础的方法。
分子诊断的特点：
灵敏度高
特异性强
适用范围广
取材一般不受组织或时相限制
分子诊断目前主要应用于
人类遗传病的基因诊断和产前诊断
肿瘤
感染性疾病病原体(细菌、病毒)
多基因病
组织器官移植配型
性别鉴定
法医学
医学分子生物学基础研究应用
肿瘤的分子诊断
与肿瘤相关的基因
* 癌基因
* 抑癌基因
* DNA错配修复基因
癌基因：是存在于致瘤病毒、人和动物细
胞中能导致细胞恶性转化，促进
细胞生长和增殖的一类基因。
Ras C-Met
Myc Mdm2
Neu Bcl-2
抑癌基因：是正常细胞内存在的能够抑制细胞恶性转化，对正常细胞的增殖起负性调节作用的基因，抑癌基因失活后正常细胞增殖失控，转化形
成肿瘤细胞。
RbPTENAPC MCCVHL
P53FHITWTIDPC4
P16BRCANF1NF2 nm23
P15DCCHNPCC
肿瘤分子诊断的基础
-基因改变
点突变
指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能。
点突变
基因扩增
是细胞原癌基因在细胞基因组内拷贝数的增加及其表达水平的增高。
* 基因扩增是由于基因DNA的过度复制所致，常引起细胞核型改变，表现为出现无着丝点的双微粒体(DMs)和缺乏正常明暗交替染色带的均匀染色区(HSRs)。
基因扩增
基因缺失
基因片段的缺失是另一种主要的基因变异形式，，缺失的范围差别较大，可以是1-2个碱基，也可以是一个片段或一个外显子的缺失。
* 杂合型缺失
* 杂合型缺失
* 正常组织杂合状态下等位基因有两条电泳带，当肿瘤组织等位DNA两条带中的一条较正常等位基因带明显减弱(>70%)则认定为LOH(图1)。
基因易位、重排
某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其他染色体的某个位置上称为易位或重排。
基因易位、重排
* 在一些肿瘤中可以见到异常的染色体，有的长些，有的短些。通过基因部分定位研究，证明在这些异常的染色体中发生了某些基因的易位和重排。
* 由于基因基因的易位和重排，原来无活性的原癌基因被移到某些强的启动基因或增强子附近而被活化，以致原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。
基因易位、重排
DNA多态性
群体中的不同个体或同一个体的不同染色体DNA核苷酸序列存在许多差异，尤其是非编码区域，大约每几百个碱基中就有一个存在着碱基取代或碱基替代现象，但表型并未改变，这种现象称为DNA多态性。实际上是染色体DNA中核苷酸排列顺序的改变。
DNA多态性
* RFLP
* VNTR
* 小卫星DNA多态
* 微卫星DNA多态
* 单核苷酸多态
RFLP
数量可变的串联重复序列
variable number of tandem repeat, VNTR
人类基因组中含有一些重复序列家族，有些序列分散在基因组中，有些是以一系列短的重复序列排列组成高变区，其串联重复序列拷贝数可相差很多，约占单倍体DNA的10%，基本上位于非编码区。重复单位以6~70bp为多，重复次数约6~100次，称为数量可变的串联重复序列。
RFLP
限制性片段长度多态性
(restriction fragment length polymorphism)
当DNA序列的差异发生在限制性内切酶识
别位点或当DNA片段的插入、缺失或重复可使
基因组DNA经限制性内切酶水解后发生片段长
度改变。因这些特异基因片段是限制性内切酶
产生的，在不同个体间可出现不同长度的限制
性片段类型，故称为限制性片段长度多态性。
小卫星DNA
细胞内基因组含有大量的碱基重复序列，一般将6~70bp的串联重复称为小卫星DNA。
微卫星DNA
将1~4bp的串联重复序列称为微卫星DNA，又称简单重复序列(simple repeat sequence, SRS)。
微卫星不稳定性
microsatelite instability,MI
是指简单重复序列的增加或丢失，特别是在DNA错配修复系统(DNA mismatch system, DNAMMR)缺损的肿瘤基因组中常显示大量的MI。
微卫星不稳定性
MI与癌基因或抑癌基因的变化之间无明显关系，即癌基
因或抑癌基因的突变并不增加微卫星的不稳定性。
MI与肿瘤的发展有关， MI仅在肿瘤细胞中发现，从未在
正常组织中检测到。
在原发与转移性肿瘤中，MI均匀分布于整个肿瘤。在晚期胃癌的MI频率显著高于早期胃癌。
端粒酶与肿瘤的关系及检测
端粒酶与肿瘤
端粒：是位于细胞染色体末端的一种由2~20kb串联的短片段重复
序列(TTAGGG)n及一些结合蛋白组成的特殊结构，在染色
体定位、复制、保护和控制细胞生长寿命等方面具有重要作
用， 并与细胞凋亡、细胞转化和永生化密切相关。
端粒酶：为由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物(RNP)，含有端粒重复序列的模板，即以自身RNA组分为模板，复
制合成端粒序列。
目前有关端粒酶活性表达的研究已覆盖了人类大部分的实体瘤。
基因变异及其检测
一、点突变
点突变的检测
* 等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide, ASO)；
* 等位基因特异性扩增法(allele-specific amplification, ASA)；
* 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisim, RFLP)分析；
* DNA测序；
* 基因芯片
一、已知点突变 的检测
点突变的检测
二、未知点突变的检测
* 单链构象多态性(single-strand conformational polymorphisim, SSCP)分析；
* 杂合双链分析法(HA)；
* 变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)；
* 突变体富集PCR法；
* DNA测序；
* 基因芯片
二、基因扩增
基因扩增的检测
-核酸分子杂交
原位杂交分类
基因探针和靶核苷酸不同
* DNA-DNA杂交
* DNA-RNA杂交
* RNA-RNA杂交
探针的标记物是
否能被直接检测
* 直接法
* 间接法
原位分子杂交技术优点
* 特异性强、灵敏度高，具有组织细胞化学染色的可见性
* 既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究
* 所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片
* 应用范围广，可对特定的基因(如癌基因、病毒基因)DNA、mRNA的表达进行定位、定性、定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究
基因扩增的检测
-核酸分子杂交
基因扩增的检测
三、基因缺失、易位与重排
杂合型缺失的检测
基因缺失、易位、重排的检测
四、基因甲基化改变的检测
五、DNA多态性及其检测
DNA多态性
RFLP
MI
Telomere
RFLP
* Southern blot ；
* PCR-RFLP
微卫星不稳定性的检测
基本方法：首先用PCR技术扩增所需的双核苷
酸重复序列，然后用凝胶电泳分析
DNA序列。
优点：比RFLP及其他Southern杂交方法
简易快速；
可对单个细胞进行检测；
可对石蜡包埋的组织进行回顾性研
究，使检测目的更明确。
端粒酶活性的检测
基本方法
TRAP法
接近闪烁分析法
TRAP-ELISA法
原位杂交法
分子诊断在肿瘤研究中的应用
肿瘤的早期诊断
* 胰腺癌：K-Ras基因的第12位编码子突变检出率达100%
* 结肠癌：PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中Ras基因突变率达33.3%
* 高危人群的筛选和临床检测：结肠癌
肿瘤易感基因的检测
已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤
* Rb1(视网膜母细胞瘤)
* WT1(肾母细胞瘤)
* P53(Li-Fraumeni综合征)
* APC(家族性腺瘤性息肉病)
* HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)
* NF1(神经纤维瘤病)
* VHL(Von Hippel-Lindau综合征)
* PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Cowden综合征)
* BRCA1(乳腺癌)
肿瘤的分类
* 限制性酶切片段多态性 (restriction fragment length polymorphism， RFLP)：用于判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源
* Bcr区基因重排：可对慢性粒细胞白血病作出诊断并可与急性粒细胞白血病进行鉴别诊断
* Myc基因检测：通过对N-Myc和C-Myc的扩增和表达检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值
肿瘤的个体化和预见性治疗
基因的变化和基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切关联，如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。
肿瘤的预后判断
* P53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后有关
* Nm23的状态与肿瘤转移有关
肿瘤的预后检测
* 在白血病的临床治疗缓解期的白血病细胞仍达1011。
* 应用细胞遗传学
分子诊断存在的问题
1操作复杂
2结果受多方面因素的影响
(技术性假阳性和假阴性)
3费用昂贵
4局限于研究领域
研究方向
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