免疫组化.ppt
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免疫组织化学技术
? 基本原理
通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体(单克隆或多克隆)检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原 - 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。
免疫组化二步法
二步法免疫组化染色步骤
? 二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯
? PBS冲洗3次，每次3分钟
? 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复
? 0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性
? PBS冲洗、浸泡5分钟，3次
? 正常山羊血清室温封闭10分钟
? 甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜
? PBS冲洗，浸泡5分钟，3次
? 滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟
? PBS冲洗，浸泡5分钟，3次
? 新鲜配置酶底物显色液DAB显色3-10分钟
? 流水冲洗
? 苏木素复染，脱水，透明，封片。
注意事项
一、抗体的保存
浓缩抗体：有效期内，只需放在
4 ℃冰箱内，保存时间可达2-5年以上。
即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内可保存一年左右。
PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-3个月。
三、出现假阴性的原因
固定时间过长，浸蜡、烤片温度过
高，导致抗原丢失，无法补救。
固定液不合适或浓度不对，导致固
定不佳。最好使用10%中性福尔马林。
抗体浓度过低。
孵育时间太短，或孵育温度太低。
缓冲液pH值不正确。
四、必须严格设置阳性对照和阴性
对照。
五、DAB有致癌性，用后不应随处
倒弃。
原 位 杂 交 技术
基本原理：用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织细胞中待测的核酸按碱基配对原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相对应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原位进行显示的方法。
优点
? 既具有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性；
? 既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织做回顾性研究；
? 需标本量少，可用活检穿刺和细胞涂片标本；
? 应用范围广泛，即可对组织细胞内特定基因和mRNA的表达进行定位、定性和定量检测，又可对病毒核酸进行组织分布、细胞及亚细胞定位研究。
分类
? 所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交 、DNA-RNA杂交 、RNA-RNA杂交 。
? 探针的标记物是否能直接被检测，原位杂交可分为直接法、间接法两类。
基本步骤及要点
探针的制备、标记 50- 300bp
? 种类DNA 探针(双链或单链)
RNA 探针
寡核苷酸探针
? 标记物放射性同位素：32P、33P、35S
非放射性标记物：生物素、地高辛....
? 标记方法切口移位法、随机引物法、末端标记法
标本制备
? 载玻片的处理
? 取材
? 固定
? 切片
整个过程中, 对内源性核酸酶的灭活和避免外源性核酸酶的污染十分重要。
杂交前处理
? 脱蜡 要充分
? 去污剂处理：增加组织的通透性，利于杂交
探针进入组织细胞。
? 蛋白酶消化：使固定后被遮蔽的靶核酸暴露，增加靶核酸的探针可及性。
? 预杂交：不含探针的杂交液在杂交温度下孵
育2小时，阻断载玻片和组织标本
中可能与探针产生非特异性结合的
位点，达到减低背景的目的。
杂交反应
? 变性 使探针与靶核酸都呈单链
95 ℃ 20min(水煮、烤箱),冰水浴5min
? 杂交液 高浓度Na+、甲酰胺、硫酸葡聚糖
BSA、鱼精DNA......
pH 6.5 - 7.5最适宜
? 杂交时间37 ℃杂交过夜(约 18h)可获最
佳信号
杂交后处理
? 洗脱
SSC (含50%甲酰胺)
目的 :
除去未结合的探针
消除与组织或细胞非特异结合的
探针
检测、复染
? 放射自显影
? 荧光显微镜
? 免疫组织化学方法
对 照
? 组织对照
阳性对照
阴性对照
? 探针对照
? 杂交对照
? 非放射性检测系统对照
免疫组织化学技术
? 基本原理
通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体(单克隆或多克隆)检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原 - 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。
免疫组化二步法
二步法免疫组化染色步骤
? 二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯
? PBS冲洗3次，每次3分钟
? 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复
? 0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性
? PBS冲洗、浸泡5分钟，3次
? 正常山羊血清室温封闭10分钟
? 甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜
? PBS冲洗，浸泡5分钟，3次
? 滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟
? PBS冲洗，浸泡5分钟，3次
? 新鲜配置酶底物显色液DAB显色3-10分钟
? 流水冲洗
? 苏木素复染，脱水，透明，封片。
注意事项
一、抗体的保存
浓缩抗体：有效期内，只需放在
4 ℃冰箱内，保存时间可达2-5年以上。
即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内可保存一年左右。
PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-3个月。
三、出现假阴性的原因
固定时间过长，浸蜡、烤片温度过
高，导致抗原丢失，无法补救。
固定液不合适或浓度不对，导致固
定不佳。最好使用10%中性福尔马林。
抗体浓度过低。
孵育时间太短，或孵育温度太低。
缓冲液pH值不正确。
四、必须严格设置阳性对照和阴性
对照。
五、DAB有致癌性，用后不应随处
倒弃。
原 位 杂 交 技术
基本原理：用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织细胞中待测的核酸按碱基配对原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相对应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在核酸原位进行显示的方法。
优点
? 既具有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性；
? 既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织做回顾性研究；
? 需标本量少，可用活检穿刺和细胞涂片标本；
? 应用范围广泛，即可对组织细胞内特定基因和mRNA的表达进行定位、定性和定量检测，又可对病毒核酸进行组织分布、细胞及亚细胞定位研究。
分类
? 所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交 、DNA-RNA杂交 、RNA-RNA杂交 。
? 探针的标记物是否能直接被检测，原位杂交可分为直接法、间接法两类。
基本步骤及要点
探针的制备、标记 50- 300bp
? 种类DNA 探针(双链或单链)
RNA 探针
寡核苷酸探针
? 标记物放射性同位素：32P、33P、35S
非放射性标记物：生物素、地高辛....
? 标记方法切口移位法、随机引物法、末端标记法
标本制备
? 载玻片的处理
? 取材
? 固定
? 切片
整个过程中, 对内源性核酸酶的灭活和避免外源性核酸酶的污染十分重要。
杂交前处理
? 脱蜡 要充分
? 去污剂处理：增加组织的通透性，利于杂交
探针进入组织细胞。
? 蛋白酶消化：使固定后被遮蔽的靶核酸暴露，增加靶核酸的探针可及性。
? 预杂交：不含探针的杂交液在杂交温度下孵
育2小时，阻断载玻片和组织标本
中可能与探针产生非特异性结合的
位点，达到减低背景的目的。
杂交反应
? 变性 使探针与靶核酸都呈单链
95 ℃ 20min(水煮、烤箱),冰水浴5min
? 杂交液 高浓度Na+、甲酰胺、硫酸葡聚糖
BSA、鱼精DNA......
pH 6.5 - 7.5最适宜
? 杂交时间37 ℃杂交过夜(约 18h)可获最
佳信号
杂交后处理
? 洗脱
SSC (含50%甲酰胺)
目的 :
除去未结合的探针
消除与组织或细胞非特异结合的
探针
检测、复染
? 放射自显影
? 荧光显微镜
? 免疫组织化学方法
对 照
? 组织对照
阳性对照
阴性对照
? 探针对照
? 杂交对照
? 非放射性检测系统对照
附件资料：
相关资料1：
- [26-医学免疫学（第6版）].曹雪涛.扫描版.pdf
- 《内部审计——公司免疫系统，提升企业价值_ 第5辑》.pdf .mobi
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- 不同生物素添加水平对肉仔鸡生长性能、血清生理生化指标和机体免疫功能的影响.pdf
- 八年制教材-医学免疫学（第二版）.pdf
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- 免疫学专业速查手册.pdf
- 2002-自身免疫性肝炎诊治指南(AIH).pdf
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