免疫组化基本技术.PPT
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参见附件(609kb)。
免疫组化基本技术
倪 灿 荣
主要内容
一、人体组织标本的取材
二、动物组织标本的取材
三、取材注意事项
四、细胞标本的准备
五、组织的固定、脱水、透明和包埋
六、切片
七、组织与细胞材料的保存
概 述
免疫组织化学(Immunohistochemistry; IHC) 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。
一、人体组织标本的取材
手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。
1.手术切除标本的取材：
抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。
组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。
2.各种小组织的活检取材：
它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。
2.注意防止人为因素的影响
刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小
厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置
要视研究目的，观察部位而定
5.取材时间
原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。
6.注意包埋方向
7.边缘标记
8.保持材料的清洁
9.切除不需要的部分
10.明确编号，登记
11.骨组织还需脱钙
四、细胞材料的准备
细胞的取材和制片法：
1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。
优点：操作简单，抗原保存好
缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背
景染色。
2.穿刺吸取法
3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
(1)常规细胞玻片制片法
(2)单核细胞分离法
3.制备细胞玻片应注意
(1)易脱片；
(2)细胞应集中在直径0.6～1.0cm的圆圈内，总数105-106；
(3)富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。
4.活细胞标本的制备法
培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将
(1)细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液(106)涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。
(2)将细胞直接培养在盖玻片上。
(3)将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。
五、组织标本的固定
1.目的
(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。
(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。
(3)使组织中的各种物质沉淀和凝固起
来而产生不同的折射率，造成光学
上的差异，以便染色后易于鉴别和
观察。
(4)固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。
(5)防止细胞过度收缩或膨胀而失
去其原有形态结构。
(6)经过固定的组织能对染料产生
不同的亲和力而着色清晰，便
于辨认。
2.固定液的种类
(1)甲醛固定液
10%福尔马林
10%中性福尔马林
10%中性缓冲福尔马林
(2)4%多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良Bouin S液
(4)Zenker S液
重铬酸钾 25mg
氯化汞 10g
冰醋酸 50ml
蒸馏水 800ml
(5)Zamboni S液
多聚甲醛 20g
饱和苦味酸 150ml
PB液至 1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加
入2.5%重铬酸钾25ml。
(8)Kanovsky S液
(9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿
30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备
用，对核内抗原的保存效果较好。
(10)PEG液
(11)0.4%对苯醌
(12)碳二亚酰胺-戊二醛(ECG-G)液
(13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇
类固定剂其固定原理主要是对蛋白
质的沉淀而发生固定作用。
3.固定方法的选择及注意事项
(1)大小 2cm×2cm×0.3cm
(2)及时固定
(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
(4)组织固定后必须彻底冲洗。
六、组织脱水、浸蜡及包埋
1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。
2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。
常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。
3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油
4.原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。
在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。
5.常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75%、85%乙醇，95%Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ
(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ
(4)石蜡包埋：修蜡块，标号
6.根据本实验室经验各种不同类型组织
的石蜡包埋条件
(1)大动物组织(狗、兔、小儿尸检)脱水、透明和浸蜡时间 ......
免疫组化基本技术
倪 灿 荣
主要内容
一、人体组织标本的取材
二、动物组织标本的取材
三、取材注意事项
四、细胞标本的准备
五、组织的固定、脱水、透明和包埋
六、切片
七、组织与细胞材料的保存
概 述
免疫组织化学(Immunohistochemistry; IHC) 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。
一、人体组织标本的取材
手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。
1.手术切除标本的取材：
抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。
组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。
2.各种小组织的活检取材：
它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。
2.注意防止人为因素的影响
刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小
厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置
要视研究目的，观察部位而定
5.取材时间
原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。
6.注意包埋方向
7.边缘标记
8.保持材料的清洁
9.切除不需要的部分
10.明确编号，登记
11.骨组织还需脱钙
四、细胞材料的准备
细胞的取材和制片法：
1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。
优点：操作简单，抗原保存好
缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背
景染色。
2.穿刺吸取法
3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
(1)常规细胞玻片制片法
(2)单核细胞分离法
3.制备细胞玻片应注意
(1)易脱片；
(2)细胞应集中在直径0.6～1.0cm的圆圈内，总数105-106；
(3)富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。
4.活细胞标本的制备法
培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将
(1)细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液(106)涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。
(2)将细胞直接培养在盖玻片上。
(3)将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。
五、组织标本的固定
1.目的
(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。
(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。
(3)使组织中的各种物质沉淀和凝固起
来而产生不同的折射率，造成光学
上的差异，以便染色后易于鉴别和
观察。
(4)固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。
(5)防止细胞过度收缩或膨胀而失
去其原有形态结构。
(6)经过固定的组织能对染料产生
不同的亲和力而着色清晰，便
于辨认。
2.固定液的种类
(1)甲醛固定液
10%福尔马林
10%中性福尔马林
10%中性缓冲福尔马林
(2)4%多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良Bouin S液
(4)Zenker S液
重铬酸钾 25mg
氯化汞 10g
冰醋酸 50ml
蒸馏水 800ml
(5)Zamboni S液
多聚甲醛 20g
饱和苦味酸 150ml
PB液至 1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加
入2.5%重铬酸钾25ml。
(8)Kanovsky S液
(9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿
30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备
用，对核内抗原的保存效果较好。
(10)PEG液
(11)0.4%对苯醌
(12)碳二亚酰胺-戊二醛(ECG-G)液
(13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇
类固定剂其固定原理主要是对蛋白
质的沉淀而发生固定作用。
3.固定方法的选择及注意事项
(1)大小 2cm×2cm×0.3cm
(2)及时固定
(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
(4)组织固定后必须彻底冲洗。
六、组织脱水、浸蜡及包埋
1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。
2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。
常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。
3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油
4.原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。
在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。
5.常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75%、85%乙醇，95%Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ
(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ
(4)石蜡包埋：修蜡块，标号
6.根据本实验室经验各种不同类型组织
的石蜡包埋条件
(1)大动物组织(狗、兔、小儿尸检)脱水、透明和浸蜡时间 ......
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