免疫组化基本技术.PPT
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参见附件(609KB)。
免疫组化基本技术
倪 灿 荣
主要内容
一、人体组织标本的取材
二、动物组织标本的取材
三、取材注意事项
四、细胞标本的准备
五、组织的固定、脱水、透明和包埋
六、切片
七、组织与细胞材料的保存
概述
免疫组织化学(Immunohistochemistry; IHC)技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。
一、人体组织标本的取材
手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。
1.手术切除标本的取材：
抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。
组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。
2.各种小组织的活检取材：
它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。
2.注意防止人为因素的影响
刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小
厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置
要视研究目的，观察部位而定
5.取材时间
原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。
6.注意包埋方向
7.边缘标记
8.保持材料的清洁
9.切除不需要的部分
10.明确编号，登记
11.骨组织还需脱钙
四、细胞材料的准备
细胞的取材和制片法：
1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。
优点：操作简单，抗原保存好
缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背
景染色。
2.穿刺吸取法
3.沉淀法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
(1)常规细胞玻片制片法
(2)单核细胞分离法
3.制备细胞玻片应注意
(1)易脱片；
(2)细胞应集中在直径0.6～1.0cm的圆圈内，总数105-106；
(3)富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。
4.活细胞标本的制备法
培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将
(1)细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液(106)涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。
(2)将细胞直接培养在盖玻片上。
(3)将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。
五、组织标本的固定
1.目的
(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。
(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。
(3)使组织中的各种物质沉淀和凝固起
来而产生不同的折射率，造成光学
上的差异，以便染色后易于鉴别和
观察。
(4)固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。
(5)防止细胞过度收缩或膨胀而失
去其原有形态结构。
(6)经过固定的组织能对染料产生
不同的亲和力而着色清晰，便
于辨认。
2.固定液的种类
(1)甲醛固定液
10%福尔马林
10%中性福尔马林
10%中性缓冲福尔马林
(2)4%多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良Bouin S液
(4)Zenker S液
重铬酸钾25mg
氯化汞10g
冰醋酸50ml
蒸馏水800ml
(5)Zamboni S液
多聚甲醛20g
饱和苦味酸150ml
PB液至1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加
入2.5%重铬酸钾25ml。
(8)Kanovsky S液
(9)Methacarn固定液甲醇60ml，氯仿
30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备
用，对核内抗原的保存效果较好。
(10)PEG液
(11)0.4%对苯醌
(12)碳二亚酰胺-戊二醛(ECG-G)液
(13)丙酮及醇类固定剂丙酮、乙醇
类固定剂其固定原理主要是对蛋白
质的沉淀而发生固定作用。
3.固定方法的选择及注意事项
(1)大小2cm×2cm×0.3cm
(2)及时固定
(3)固定时间固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
(4)组织固定后必须彻底冲洗。
六、组织脱水、浸蜡及包埋
1.目的由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。
2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。
常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。
3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油
4.原则脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。
在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。
5.常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75%、85%乙醇，95%Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ
(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ
(4)石蜡包埋：修蜡块，标号
6.根据本实验室经验各种不同类型组织
的石蜡包埋条件
(1)大动物组织(狗、兔、小儿尸检)脱水、透明和浸蜡时间
75%乙醇30～120min，85%乙醇30～120min，95%乙醇Ⅰ 2h，95%乙醇Ⅱ 2h，95%乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可视观察结果而定)，石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。
(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间
75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min, Ⅱ10min，Ⅲ10min(肉眼观察)，石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。
(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸
蜡时间
75%乙醇30min，85%乙醇1h，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h和Ⅲ4h或过夜，无水乙醇Ⅰ30min，Ⅱ1～2h和Ⅲ4h，二甲苯Ⅰ30min，Ⅱ30min和Ⅲ1h。
七、组织切片
切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。
1.切片前的准备工作
(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。
(2)切片粘合剂的种类
多聚赖氨酸(分子量300KD)：0.5%浓度。
APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷)：干净载玻片→丙酮5min →APES(1ml+50ml丙酮)：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。
铬矾明胶液：
铬矾0.5g明胶5gH2O2 1000ml
甲醛明胶液：
40%甲醛2.5ml明胶0.5g H2O2 100ml
2.石蜡切片：
3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片
(恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机)
4.切片要求及注意事项：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。
(2)52-60℃烤片18h。
(3)切片厚2～4μm。
(4)切片刀要快
(5)编上号
(6)切片可在4℃保存数年(石蜡切片)
(7)冰冻切片后需凉干后立即固定
(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组
织需经庶糖处理24h，冰冻切片。
(9)冰冻切片固定后-80℃保存备用
八、组织与细胞材料的保存
1.冷冻保存：
-80℃，-145℃，-198℃
组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。
2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管
中，-80℃冻存。
3.蜡块的保存
4.活细胞的保存可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。
第二部分
IHC的一些基本技术
主要内容
一、实验的设计
二、石蜡切片的脱蜡至水
三、内源性酶的消除方法
四、IHC的非特异性染色
五、抗原的暴露和修复
六、抗体的购置及注意事项
七、抗体最佳稀释度的测定和保存
八、显示系统及衬染剂的选择和配制
九、IHC常用缓冲液
一、实验的设计
1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。
2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前
处理方式。
3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。
4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育
时间和温度，同一的显色时间。
5.列出阳性判定的标准
6.预期达到的目标
二、石蜡切片脱蜡至水
冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。
二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯10minⅢ，无水乙醇2min，95%乙醇2min，85%乙醇2min，75%乙醇2min，流水冲洗。
三、内源性酶的消除方法
(一)内源性过氧化物酶的消除方法：
1.0.3%～3%H2O2甲醇液20min
2.1% H2O2 20min
3.3%苯肼溶液37℃1h
4.0.075%盐酸甲醇液30min
(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法
1. 10%醋酸10min
2. 0.5mol/L碳酸氢钠(pH9.0) 20min
3. 1mol/L左旋咪唑20min
(三)内源性生物素的消除方法
1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素
2.先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。
四、IHC的非特异性染色
1.特异性抗体不纯
2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。
3.IgG的交叉反应
4.共同抗原决定簇
5.单一决定簇抗体的异质性
6.特异性抗原弥散
7.IgG受体干扰
8.鼠源性抗体检测鼠源性组织
解决方法：
1.用正常二抗血清吸附
2.将组织用酶消化或抗原修复
3.二抗用木瓜酶将抗体结合部Fab切除
4.高度稀释特异性一抗
五、酶消化和抗原修复
1.为什么要进行酶消化和抗原修复？
(1)固定液的影响 自1893年Ferdinand Blum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。
目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。
甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。
(2)抗体制备的影响
2.酶消化
(1)原理：
1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白
2)断交联
(2)蛋白酶的种类
胰蛋白酶0.05%～0.1%胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。
胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCI稀释，消化时间37℃ 30～180min。......（后略) ......
免疫组化基本技术
倪 灿 荣
主要内容
一、人体组织标本的取材
二、动物组织标本的取材
三、取材注意事项
四、细胞标本的准备
五、组织的固定、脱水、透明和包埋
六、切片
七、组织与细胞材料的保存
概述
免疫组织化学(Immunohistochemistry; IHC)技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。
一、人体组织标本的取材
手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。
1.手术切除标本的取材：
抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。
组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。
2.各种小组织的活检取材：
它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。
2.注意防止人为因素的影响
刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小
厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置
要视研究目的，观察部位而定
5.取材时间
原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。
6.注意包埋方向
7.边缘标记
8.保持材料的清洁
9.切除不需要的部分
10.明确编号，登记
11.骨组织还需脱钙
四、细胞材料的准备
细胞的取材和制片法：
1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。
优点：操作简单，抗原保存好
缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背
景染色。
2.穿刺吸取法
3.沉淀法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
(1)常规细胞玻片制片法
(2)单核细胞分离法
3.制备细胞玻片应注意
(1)易脱片；
(2)细胞应集中在直径0.6～1.0cm的圆圈内，总数105-106；
(3)富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。
4.活细胞标本的制备法
培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将
(1)细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液(106)涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。
(2)将细胞直接培养在盖玻片上。
(3)将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。
五、组织标本的固定
1.目的
(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。
(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。
(3)使组织中的各种物质沉淀和凝固起
来而产生不同的折射率，造成光学
上的差异，以便染色后易于鉴别和
观察。
(4)固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。
(5)防止细胞过度收缩或膨胀而失
去其原有形态结构。
(6)经过固定的组织能对染料产生
不同的亲和力而着色清晰，便
于辨认。
2.固定液的种类
(1)甲醛固定液
10%福尔马林
10%中性福尔马林
10%中性缓冲福尔马林
(2)4%多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良Bouin S液
(4)Zenker S液
重铬酸钾25mg
氯化汞10g
冰醋酸50ml
蒸馏水800ml
(5)Zamboni S液
多聚甲醛20g
饱和苦味酸150ml
PB液至1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加
入2.5%重铬酸钾25ml。
(8)Kanovsky S液
(9)Methacarn固定液甲醇60ml，氯仿
30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备
用，对核内抗原的保存效果较好。
(10)PEG液
(11)0.4%对苯醌
(12)碳二亚酰胺-戊二醛(ECG-G)液
(13)丙酮及醇类固定剂丙酮、乙醇
类固定剂其固定原理主要是对蛋白
质的沉淀而发生固定作用。
3.固定方法的选择及注意事项
(1)大小2cm×2cm×0.3cm
(2)及时固定
(3)固定时间固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
(4)组织固定后必须彻底冲洗。
六、组织脱水、浸蜡及包埋
1.目的由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。
2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。
常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。
3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油
4.原则脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。
在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。
5.常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75%、85%乙醇，95%Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ
(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ
(4)石蜡包埋：修蜡块，标号
6.根据本实验室经验各种不同类型组织
的石蜡包埋条件
(1)大动物组织(狗、兔、小儿尸检)脱水、透明和浸蜡时间
75%乙醇30～120min，85%乙醇30～120min，95%乙醇Ⅰ 2h，95%乙醇Ⅱ 2h，95%乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可视观察结果而定)，石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。
(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间
75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min, Ⅱ10min，Ⅲ10min(肉眼观察)，石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。
(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸
蜡时间
75%乙醇30min，85%乙醇1h，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h和Ⅲ4h或过夜，无水乙醇Ⅰ30min，Ⅱ1～2h和Ⅲ4h，二甲苯Ⅰ30min，Ⅱ30min和Ⅲ1h。
七、组织切片
切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。
1.切片前的准备工作
(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。
(2)切片粘合剂的种类
多聚赖氨酸(分子量300KD)：0.5%浓度。
APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷)：干净载玻片→丙酮5min →APES(1ml+50ml丙酮)：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。
铬矾明胶液：
铬矾0.5g明胶5gH2O2 1000ml
甲醛明胶液：
40%甲醛2.5ml明胶0.5g H2O2 100ml
2.石蜡切片：
3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片
(恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机)
4.切片要求及注意事项：
(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。
(2)52-60℃烤片18h。
(3)切片厚2～4μm。
(4)切片刀要快
(5)编上号
(6)切片可在4℃保存数年(石蜡切片)
(7)冰冻切片后需凉干后立即固定
(8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组
织需经庶糖处理24h，冰冻切片。
(9)冰冻切片固定后-80℃保存备用
八、组织与细胞材料的保存
1.冷冻保存：
-80℃，-145℃，-198℃
组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。
2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管
中，-80℃冻存。
3.蜡块的保存
4.活细胞的保存可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。
第二部分
IHC的一些基本技术
主要内容
一、实验的设计
二、石蜡切片的脱蜡至水
三、内源性酶的消除方法
四、IHC的非特异性染色
五、抗原的暴露和修复
六、抗体的购置及注意事项
七、抗体最佳稀释度的测定和保存
八、显示系统及衬染剂的选择和配制
九、IHC常用缓冲液
一、实验的设计
1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。
2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前
处理方式。
3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。
4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育
时间和温度，同一的显色时间。
5.列出阳性判定的标准
6.预期达到的目标
二、石蜡切片脱蜡至水
冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。
二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯10minⅢ，无水乙醇2min，95%乙醇2min，85%乙醇2min，75%乙醇2min，流水冲洗。
三、内源性酶的消除方法
(一)内源性过氧化物酶的消除方法：
1.0.3%～3%H2O2甲醇液20min
2.1% H2O2 20min
3.3%苯肼溶液37℃1h
4.0.075%盐酸甲醇液30min
(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法
1. 10%醋酸10min
2. 0.5mol/L碳酸氢钠(pH9.0) 20min
3. 1mol/L左旋咪唑20min
(三)内源性生物素的消除方法
1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素
2.先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。
四、IHC的非特异性染色
1.特异性抗体不纯
2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。
3.IgG的交叉反应
4.共同抗原决定簇
5.单一决定簇抗体的异质性
6.特异性抗原弥散
7.IgG受体干扰
8.鼠源性抗体检测鼠源性组织
解决方法：
1.用正常二抗血清吸附
2.将组织用酶消化或抗原修复
3.二抗用木瓜酶将抗体结合部Fab切除
4.高度稀释特异性一抗
五、酶消化和抗原修复
1.为什么要进行酶消化和抗原修复？
(1)固定液的影响 自1893年Ferdinand Blum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。
目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。
甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。
(2)抗体制备的影响
2.酶消化
(1)原理：
1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白
2)断交联
(2)蛋白酶的种类
胰蛋白酶0.05%～0.1%胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37℃ 30min。
胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1N HCI稀释，消化时间37℃ 30～180min。......（后略) ......
附件资料：
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