人体疟原虫镜检技术.ppt
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参见附件(2210KB)。
人体疟原虫镜检技术
沈毓祖
安徽省疾病预防控制中心
一、概述
疟原虫属原生动物亚界的真核单细胞动物。在生物界的位置：疟原虫为原生动物门、孢子纲、血孢子目、疟原虫科、疟原虫属。疟原虫有149种，目前公认的自然界感染人体的疟原虫只有四种：即间日疟(Pv)、恶性疟(Pf)、三日疟(Pm)、蛋形疟(PO)四种。
二、疟原虫生活史
1、红细胞外期
2、红细胞内期
3、子孢子增殖期
周围血液中各种血细胞的形态
薄血膜间日疟环状体
薄血膜间日疟环状体
恶性疟薄血膜环状体
薄血膜恶性疟环状体
薄血膜恶性疟环状体
薄血膜间日疟滋养体
薄血膜间日疟滋养体
薄血膜间日疟未成熟裂殖体
薄血膜间日疟成熟裂殖体
薄血膜间日疟成熟裂殖体
薄血膜间日疟成熟裂殖体
薄血膜配子体
薄血膜配子体
恶性疟配子体
恶性疟配子体
恶性疟配子体
2、厚血膜上疟原虫形态特征
2.1环状体(R)
2.1.1间日疟环状体
2.1.2恶性疟环状体
2.2滋养体(T)
2.2.1间日疟滋养体
2.2.2恶性疟滋养
2.3早期裂埴体(早S)
2.3.1间日疟裂埴体
2.3.2恶性疟裂埴体
2.4晚期裂埴体
2.4.1间日疟晚期裂埴体
2.4.2恶性疟晚期裂埴体
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟滋养体
厚血膜恶性疟配子体
厚血膜恶性疟环状体
2.5配子体(G)
2.5.1间日疟配子体
2.5.1.1完整的配子体
2.5.1.2浆裂断收缩，核与色素如常
2.5.1.3浆已腐蚀消失，仅有核与色素
2.5.1.4核消失，仅有浆与色素
2.5.l.5核浆均已消失。仅有色素颗粒，以其沿边分布 的特点即可确认
2.5.2恶性疟配子体
2.5.2.1正常配子体
2.5.2.2圆形配子体
2.5.2.3梭形(枪形)配子体
2.5.2.4腐蚀的配子体
四、疟原虫与其它物体的鉴别
1、疑似疟色素
2、疑似疟原虫核
3、疑似原虫胞浆
4、白细胞的破碎残骸
5、幼红细胞残骸
五、镜检工作所需注意的事项
1、在镜检中显微镜的使用：油镜、凹镜、视野需按一宝顺序逐个检查。
2、疟原虫镜检工作中，凡是发热病人。疟疾、疑似疟疾、及不明原因的发热病人均需进行疟原虫镜检。
3、做好镜检登记：凡是镜检疟原虫的均需如实登记，阴、阳性片保存待考核。
4、每一个月上报一次镜检数。包括镜检人数、阳性、阴性。
5、如发现恶性疟以嘴快的通信方法，在24小时内报县、市、省疾病预防控制机构，阳性血片留待上级复核。
六、血片制作与染色
1、血片的清洁
新的载皮片必须洗洁净后才可直接浸于 9 5%的酒精中，然后一一取出，用软而洁净并没有棉花毛的细布擦干，擦亮，妥善放置，勿使灰尘沾污。
用过的载玻片可用5%之煮沸肥皂水洗涤，将玻片一张一张的放入其中待肥皂水稍冷后，用毛刷或纱布细心拭擦。再用清水漂洗干净并以纱布擦干，然后浸于 95%酒精内脱脂，照上述法处理，亦可用洗涤液清洗，在整个擦洗过程中，应注意避免玻片互相磨擦，而使玻片面磨毛，以致不堪使用。
采血的部位和方法
* 以耳垂采血为主。
* 以75%酒精棉球消毒耳垂待酒精干后，左手拇指和食指紧捏耳垂，右手持一次性采血针迅速刺入，适可而止第一滴血不必擦掉，即可应用。(若由指头取血则受检者痛楚较大，且易引起创口感染，一投不宜采用。)
采血的血量
* 厚血膜血量约为5立方毫米左右(即一小滴)，涂成边缘光滑之园形，直径约0.8-1.0厘米左右。
* 薄血膜血量只需0.5-1.0立方毫米左右,过多则血膜过厚过大。薄膜宜涂成舌状长约2.5厘米，宽约2厘米
采血的时间
* 进行疟疾普查时，在同一时间内常常需要检查很多居民，故一般无法考虑取血的时间。
* 但在诊断临床的疟疾患者时，就应当考虑在什么时候取血较为适宜，尤在确定不下虫种和查不到疟原虫的疑似疟疾患者的情况下。
采血的时间---间日疟
* 间日疟原虫及三日疟原虫，在患者刚发冷发热以后，大部是在环状滋养体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。虽在-般情况下，随便什么时间检查感染者的末稍血液,多少能查到各个时期的原虫，但适当的取血时间，一般是在患者发作数小时至十余小时，即已滋养发育至具有易于鉴别的晚期滋养体期.
采血的时间---恶性疟
* 恶性疟原虫，从理论上说，因为恶性原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末稍血液中不易查到。但实际情况不尽如此，一般在受染者的末稍血液中，随时能见到少数恶性疟原虫的环状滋养体，* 虽然如此，较理想的取血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状滋养体虽已滋长发育至最高峰，但尚未回至内脏的毛细血管中去进行裂体生殖。
* 环状滋养体的数量与构造，有助于疟原虫种类的鉴别。恶性疟原虫的配子体很易识别，但在初发时，一般需要在发作八日后才能在末稍血液中出现，应当注意
厚、薄血膜的形状和位置
* 薄血膜宽2cm，长2.5cm
* 厚血膜直径0.8-1cm
* 假定将玻片划成三格等分，则厚血膜应位于中格靠右侧线处，薄血膜则从玻片中央起至左格中部止，右端空格供记录姓名，编号或贴标签之用(如图)
血片的制作1
* 玻片的执持方法：
无论在拭擦玻片，制作血片或染色血片时，手指仅可夹持玻片两侧缘，切匆触及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血涂布不匀，厚血膜易于脱落
4、厚血膜涂制
* 取洁净的载玻片和推片各一张载玻片放桌上，推片以右手拇指和食指持其二侧，以左端下角从受检者之耳垂沾取血滴，在载玻片之适当位置，自内向外回转扩大，涂成厚血膜，使厚薄均匀。涂毕后用干棉球拭掉推片上和耳垂上之残留小量血液。
血片的制作-厚血膜涂制
* 取洁净的载玻片和推片各一张载玻片放桌上，推片以右手拇指和食指持其二侧，以左端下角从受检者之耳垂沾取血滴，在载玻片之适当位置，自内向外回转扩大，涂成厚血膜，使厚薄均匀。涂毕后用干棉球拭掉推片上和耳垂上之残留小量血液。
血片的制作--薄血膜涂制
* 以推片左端中央沾取薄血膜所需之血，与载玻片约成25一45度角，使血滴向二旁扩展至一定宽度时，立即向左边轻轻迅速推出即成薄血膜。推时速度之快慢和角度均影响血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布排列比较均匀。无裂缝，无空隙。
血片的编号
* 血片编号可根据实际操作进行。
* 号码必须不易脱落，建议用铅笔在薄血膜上编号。
血片的固定和脱膜
* 薄血膜用甲醇固定
* 现场检查的血片厚血膜可以不脱血膜，直接染色。
* 保存时间较长的标本片厚血膜要脱血膜后保存。
血片制作的注意事项
* 平放、 有盖、 防止灰、尘和植物孢子污染。
* 防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸
* 自然干燥，不能太阳晒和火烤
制作血片的注意事项
* 制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购置之标本盒内，以免血红蛋白凝固无法脱除。血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细 胞沉在一边，可使厚薄不匀。此外还要防止苍蝇吮吸血膜和灰尘污染血片。
*制成的血膜须完全干燥后(自然情况下约4-12小时才能全干燥；必要时，可置于3 7℃的暖箱中，促其速干)始可进行固定及染色否则薄血膜中的红细胞边缘皱缩，厚血膜容易在染色时脱落，而常现网状的背景；反之；血片搁置过久则有霉菌及枯草杆菌生长，血红蛋白凝固，也不能使用，因此不利于镜检。
* 若把未经固定的血片能盛于氯化钙的干燥器内，然后放入冰箱中，可保存3年之久，并仍可较满意的染色。
血片的染色
* 吉氏染液的成份
* 原料：吉氏染粉10 g
中性甘油500 ml
纯甲醇500 ml
吉氏液染色方法
将吉氏染液配成3%的稀释液
水97 ml+3 ml吉氏液
PH7.0--7.2
染色25-30分钟
影响染色效果的因素
* 染料和溶剂的质量
* 染液的新旧
* 染液稀释后的使用时间
* 染液的稀释浓度
* 染色时间：根据染液质量、新旧、浓度和气温
* 染色用水PH7.0-7.2
谢谢~~~
人体疟原虫镜检技术
沈毓祖
安徽省疾病预防控制中心
一、概述
疟原虫属原生动物亚界的真核单细胞动物。在生物界的位置：疟原虫为原生动物门、孢子纲、血孢子目、疟原虫科、疟原虫属。疟原虫有149种，目前公认的自然界感染人体的疟原虫只有四种：即间日疟(Pv)、恶性疟(Pf)、三日疟(Pm)、蛋形疟(PO)四种。
二、疟原虫生活史
1、红细胞外期
2、红细胞内期
3、子孢子增殖期
周围血液中各种血细胞的形态
薄血膜间日疟环状体
薄血膜间日疟环状体
恶性疟薄血膜环状体
薄血膜恶性疟环状体
薄血膜恶性疟环状体
薄血膜间日疟滋养体
薄血膜间日疟滋养体
薄血膜间日疟未成熟裂殖体
薄血膜间日疟成熟裂殖体
薄血膜间日疟成熟裂殖体
薄血膜间日疟成熟裂殖体
薄血膜配子体
薄血膜配子体
恶性疟配子体
恶性疟配子体
恶性疟配子体
2、厚血膜上疟原虫形态特征
2.1环状体(R)
2.1.1间日疟环状体
2.1.2恶性疟环状体
2.2滋养体(T)
2.2.1间日疟滋养体
2.2.2恶性疟滋养
2.3早期裂埴体(早S)
2.3.1间日疟裂埴体
2.3.2恶性疟裂埴体
2.4晚期裂埴体
2.4.1间日疟晚期裂埴体
2.4.2恶性疟晚期裂埴体
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟原虫形态
厚血膜间日疟滋养体
厚血膜恶性疟配子体
厚血膜恶性疟环状体
2.5配子体(G)
2.5.1间日疟配子体
2.5.1.1完整的配子体
2.5.1.2浆裂断收缩，核与色素如常
2.5.1.3浆已腐蚀消失，仅有核与色素
2.5.1.4核消失，仅有浆与色素
2.5.l.5核浆均已消失。仅有色素颗粒，以其沿边分布 的特点即可确认
2.5.2恶性疟配子体
2.5.2.1正常配子体
2.5.2.2圆形配子体
2.5.2.3梭形(枪形)配子体
2.5.2.4腐蚀的配子体
四、疟原虫与其它物体的鉴别
1、疑似疟色素
2、疑似疟原虫核
3、疑似原虫胞浆
4、白细胞的破碎残骸
5、幼红细胞残骸
五、镜检工作所需注意的事项
1、在镜检中显微镜的使用：油镜、凹镜、视野需按一宝顺序逐个检查。
2、疟原虫镜检工作中，凡是发热病人。疟疾、疑似疟疾、及不明原因的发热病人均需进行疟原虫镜检。
3、做好镜检登记：凡是镜检疟原虫的均需如实登记，阴、阳性片保存待考核。
4、每一个月上报一次镜检数。包括镜检人数、阳性、阴性。
5、如发现恶性疟以嘴快的通信方法，在24小时内报县、市、省疾病预防控制机构，阳性血片留待上级复核。
六、血片制作与染色
1、血片的清洁
新的载皮片必须洗洁净后才可直接浸于 9 5%的酒精中，然后一一取出，用软而洁净并没有棉花毛的细布擦干，擦亮，妥善放置，勿使灰尘沾污。
用过的载玻片可用5%之煮沸肥皂水洗涤，将玻片一张一张的放入其中待肥皂水稍冷后，用毛刷或纱布细心拭擦。再用清水漂洗干净并以纱布擦干，然后浸于 95%酒精内脱脂，照上述法处理，亦可用洗涤液清洗，在整个擦洗过程中，应注意避免玻片互相磨擦，而使玻片面磨毛，以致不堪使用。
采血的部位和方法
* 以耳垂采血为主。
* 以75%酒精棉球消毒耳垂待酒精干后，左手拇指和食指紧捏耳垂，右手持一次性采血针迅速刺入，适可而止第一滴血不必擦掉，即可应用。(若由指头取血则受检者痛楚较大，且易引起创口感染，一投不宜采用。)
采血的血量
* 厚血膜血量约为5立方毫米左右(即一小滴)，涂成边缘光滑之园形，直径约0.8-1.0厘米左右。
* 薄血膜血量只需0.5-1.0立方毫米左右,过多则血膜过厚过大。薄膜宜涂成舌状长约2.5厘米，宽约2厘米
采血的时间
* 进行疟疾普查时，在同一时间内常常需要检查很多居民，故一般无法考虑取血的时间。
* 但在诊断临床的疟疾患者时，就应当考虑在什么时候取血较为适宜，尤在确定不下虫种和查不到疟原虫的疑似疟疾患者的情况下。
采血的时间---间日疟
* 间日疟原虫及三日疟原虫，在患者刚发冷发热以后，大部是在环状滋养体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。虽在-般情况下，随便什么时间检查感染者的末稍血液,多少能查到各个时期的原虫，但适当的取血时间，一般是在患者发作数小时至十余小时，即已滋养发育至具有易于鉴别的晚期滋养体期.
采血的时间---恶性疟
* 恶性疟原虫，从理论上说，因为恶性原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末稍血液中不易查到。但实际情况不尽如此，一般在受染者的末稍血液中，随时能见到少数恶性疟原虫的环状滋养体，* 虽然如此，较理想的取血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状滋养体虽已滋长发育至最高峰，但尚未回至内脏的毛细血管中去进行裂体生殖。
* 环状滋养体的数量与构造，有助于疟原虫种类的鉴别。恶性疟原虫的配子体很易识别，但在初发时，一般需要在发作八日后才能在末稍血液中出现，应当注意
厚、薄血膜的形状和位置
* 薄血膜宽2cm，长2.5cm
* 厚血膜直径0.8-1cm
* 假定将玻片划成三格等分，则厚血膜应位于中格靠右侧线处，薄血膜则从玻片中央起至左格中部止，右端空格供记录姓名，编号或贴标签之用(如图)
血片的制作1
* 玻片的执持方法：
无论在拭擦玻片，制作血片或染色血片时，手指仅可夹持玻片两侧缘，切匆触及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血涂布不匀，厚血膜易于脱落
4、厚血膜涂制
* 取洁净的载玻片和推片各一张载玻片放桌上，推片以右手拇指和食指持其二侧，以左端下角从受检者之耳垂沾取血滴，在载玻片之适当位置，自内向外回转扩大，涂成厚血膜，使厚薄均匀。涂毕后用干棉球拭掉推片上和耳垂上之残留小量血液。
血片的制作-厚血膜涂制
* 取洁净的载玻片和推片各一张载玻片放桌上，推片以右手拇指和食指持其二侧，以左端下角从受检者之耳垂沾取血滴，在载玻片之适当位置，自内向外回转扩大，涂成厚血膜，使厚薄均匀。涂毕后用干棉球拭掉推片上和耳垂上之残留小量血液。
血片的制作--薄血膜涂制
* 以推片左端中央沾取薄血膜所需之血，与载玻片约成25一45度角，使血滴向二旁扩展至一定宽度时，立即向左边轻轻迅速推出即成薄血膜。推时速度之快慢和角度均影响血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布排列比较均匀。无裂缝，无空隙。
血片的编号
* 血片编号可根据实际操作进行。
* 号码必须不易脱落，建议用铅笔在薄血膜上编号。
血片的固定和脱膜
* 薄血膜用甲醇固定
* 现场检查的血片厚血膜可以不脱血膜，直接染色。
* 保存时间较长的标本片厚血膜要脱血膜后保存。
血片制作的注意事项
* 平放、 有盖、 防止灰、尘和植物孢子污染。
* 防止苍蝇、蟑螂等昆虫吮吸
* 自然干燥，不能太阳晒和火烤
制作血片的注意事项
* 制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购置之标本盒内，以免血红蛋白凝固无法脱除。血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细 胞沉在一边，可使厚薄不匀。此外还要防止苍蝇吮吸血膜和灰尘污染血片。
*制成的血膜须完全干燥后(自然情况下约4-12小时才能全干燥；必要时，可置于3 7℃的暖箱中，促其速干)始可进行固定及染色否则薄血膜中的红细胞边缘皱缩，厚血膜容易在染色时脱落，而常现网状的背景；反之；血片搁置过久则有霉菌及枯草杆菌生长，血红蛋白凝固，也不能使用，因此不利于镜检。
* 若把未经固定的血片能盛于氯化钙的干燥器内，然后放入冰箱中，可保存3年之久，并仍可较满意的染色。
血片的染色
* 吉氏染液的成份
* 原料：吉氏染粉10 g
中性甘油500 ml
纯甲醇500 ml
吉氏液染色方法
将吉氏染液配成3%的稀释液
水97 ml+3 ml吉氏液
PH7.0--7.2
染色25-30分钟
影响染色效果的因素
* 染料和溶剂的质量
* 染液的新旧
* 染液稀释后的使用时间
* 染液的稀释浓度
* 染色时间：根据染液质量、新旧、浓度和气温
* 染色用水PH7.0-7.2
谢谢~~~
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