血管紧张素Ⅱ和胰岛素对平滑肌细胞三磷酸肌醇活性的影响.ppt
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血管紧张素Ⅱ和胰岛素对平滑肌细胞三磷酸肌醇活性的影响
天津医科大学第二医院心脏科
马向红
前言
> 肾素-血管紧张素系统在高血压的发病机制中具有重要作用，临床研究发现高血压患者较正常血压者更易发生糖尿病，糖尿病患者发生高血压的危险性高于血压正常者，高血压和糖尿病患者常表现为胰岛素抵抗。
> 血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素1型(AT1)受体拮抗剂不仅能降低血压，而且能提高胰岛素的敏感性，提示血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与胰岛素抵抗之间具有相互作用。
前言
* AngII可以激活磷脂酶水解细胞膜磷脂并产生信号分子，在培养的平滑肌细胞5秒钟之内PLC被激活，水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)生成肌醇1，4，5-三磷酸 (inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油(diacyl glycerol, DG)。
* IP3和DG作为第二信使分别激动两个信号传递途径即IP3/Ca2+和DG/PKC通路，IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca2+释放，引起胞内Ca2+水平增加，从而启动胞内Ca2+信号系统，即通过依赖Ca2+、钙结合蛋白(如钙调素)的酶类活性变化来调节生理过程。
前言
* 然而，AngⅡ与胰岛素同时存在情况下对IP3和钙调素活性的影响目前尚不十分清楚。本文旨在探讨AngII和胰岛素对人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响。
材料和方法
* 人脐动脉平滑肌细胞培养和鉴定：采用组织贴块法，?-actin免疫组织化学检查细胞胞浆呈棕褐色鉴定为平滑肌细胞。
第2-3代细胞用于实验，用胰蛋白酶消化后接种于24孔培养板，浓度为2×106/ml。静置24小时后换成无血清细胞培养液，孵育24小时使细胞处于静止状态再进行实验。
实验分组：
* 对照组，为无血清的M1640培养液
* 不同浓度胰岛素组(10、100、1000mU/L)
* 不同浓度血管紧张素Ⅱ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)
* 不同浓度胰岛素(10、100、1000mU/L)+不同浓度AngⅡ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)
* 不同浓度AngⅡ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)+不同浓度losartan组(1、5、10μM)
每组为6孔细胞。
检测方法：实验24小时后刮取细胞测定钙调素(CaM)和三磷酸肌醇(IP3)。
* 钙调素测定：采用磷酸二酯酶(PDE)法。
贴壁培养的人脐动脉平滑肌细胞，用预冷的PBS缓冲液洗3遍，用细胞刮将细胞刮下，制成细胞悬液，细胞数为2?106/ml。
加入50?lPDE混合液，混匀，30?C 预热10分钟。
加入100?l反应混合液，30?C水浴20分钟，煮沸1分钟。
立即放入冰水浴中，加入1mg/ml蛇毒50?l，混匀，放置30?C水浴中保温20分钟。
加入30% Dowex 400?l，混匀，1000转/分离心10分钟，取上清液200?l置于闪烁瓶中。
加入3ml无水乙醇和7ml闪烁液，于?液闪计数仪中测定cpm，根据标准曲线计算出钙调素含量。
* IP3测定：6孔板培养的平滑肌细胞，加入3H-肌醇 (10?Ci/孔，由中国原子能研究院标记)和不同浓度的胰岛素、AngⅡ和Losartan培养24小时。
弃去培养液，用预保温的反应缓冲液洗1次，弃去。
用2ml反应缓冲液37 ?C孵育10分钟，弃去，重复一次。
加入氯仿/甲醇/盐酸(1:2:0.25，V/V/V)1ml终止反应。
刮取细胞，收集细胞于离心管中，加入0.6ml氯仿/水(1:1，V/V)，振摇。
1000转/分离心5分钟，70?C水浴保温10分钟取出氯仿，收集水相层(约0.4ml)于柱中。
先后经过10ml双蒸水，10ml 60mM甲酸铵/5mM硼酸钠、10ml 0.2M甲酸铵/0.1M甲酸、10ml 0.7M甲酸铵/0.1M甲酸、10ml 1.05M甲酸铵/0.1M甲酸逐步洗脱。
流速3-4滴/分钟。
收集1.05M甲酸铵/0.1M甲酸过柱后含有IP3的洗脱液。
取2ml洗脱液于闪烁瓶中，60?C蒸发至残余液体约200?l，加入闪烁液和无水乙醇，?液闪仪计数，IP3以cpm/孔表示。
统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS10.0统计软件处理，多组间比较用方差分析，两两比较用q检验。p<0.05具有统计学差异。
结果
表1 胰岛素对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)
注：Insulin：胰岛素(单位：mU/L)。
表2 血管紧张素Ⅱ对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)
注：*与对照组相比p<0.05。AngⅡ：血管紧张素Ⅱ(单位：nM)。
表3 胰岛素和血管紧张素Ⅱ对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)
注：*与对照组相比p<0.05。Insulin：胰岛素(单位：mU/L)，AngⅡ：血管紧张素Ⅱ(单位：nM)。
表4Losartan对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)
注：AngII：血管紧张素Ⅱ(单位：nM)，losartan(单位：μM)。
讨论
本研究结果显示胰岛素对人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性无影响。
胰岛素主要通过2条信号转导途径发挥其生物学效应：PI3-K和MAPK途径。
胰岛素与胰岛素受体结合以后，使胰岛素受体的β亚基磷酸化，进一步使胰岛素受体底物(IRS)的酪氨酸磷酸化，IRS-1与PI3-K的调节亚基p85结合形成IRS-1/PI3-K复合物，使PIP2肌醇环上3位磷酸化，生成PI(3，4，5)P。
讨论
PIP3作为第二信使与含有SH2区段的信号蛋白结合，激活Akt，产生一系列生物学效应，如促进葡萄糖转运、糖原合成和刺激NO产生等。而激活MAPK途径与有丝分裂有关，如细胞生长和增生。
讨论
本文研究结果还显示AngⅡ使人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性增加，可以被Losartan阻断。Losartan是选择性AngII 1型受体(AT1)拮抗剂，说明AngⅡ引起上述病理改变是AT1受体介导的。
AngII与AT1结合，通过G蛋白介导，可以激活平滑肌细胞PLC，水解PIP2生成IP3 ，IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca2+释放，引起胞内Ca2+水平增加，从而启动胞内Ca2+信号系统，即通过依赖Ca2+、钙调素的酶类活性变化来调节生理过程。 Ca2+-钙调素激活肌球蛋白轻链，使肌球蛋白轻链磷酸化，在肌肉收缩中具有重要作用。
讨论
胰岛素和AngⅡ同时存在时，人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性增加更为明显，可能与AngⅡ影响胰岛素信号转导，使胰岛素对PI3-K的激活作用减弱有关。
AngⅡ可以从多个水平影响胰岛素信号转导，如抑制IRS-1酪氨酸磷酸化、促进胰岛素受体β亚基或IRS-1丝氨酸磷酸化而抑制IRS-1对PI3-K的激活，使平滑肌细胞对胰岛素的敏感性下降，促进胰岛素抵抗的发生。
讨论
PIP2是PLC和PI3-K的共同底物，由于AngⅡ抑制了胰岛素对PI3-K的激活，故PIP2更多的被PLC水解为IP3，因此，胰岛素和AngⅡ同时存在时，平滑肌细胞IP3活性增加更为明显，IP3进一步激活Ca2+/钙调素系统(如图所示)。
讨论
AngⅡ Ins
(-)
AT1-R (-) IR
(-)
G蛋白IRS-1或IRS-2
PLCPI3-K
IP3PIP2 PIP3
(+)
Ca2+ Akt
(+)(+)
Ca2+/CaMNO
图: 胰岛素和血管紧张素Ⅱ信号转导途径之间的相互联系和相互影响
结论
综上所述，高浓度胰岛素对IP3和钙调素活性无影响，AngⅡ可以使IP3和钙调素活性升高，胰岛素和AngⅡ同时存在时培养的平滑肌细胞IP3和钙调素活性升高更为明显， AngII引起IP3和钙调素活性升高是AT1受体介导的。
血管紧张素Ⅱ和胰岛素对平滑肌细胞三磷酸肌醇活性的影响
天津医科大学第二医院心脏科
马向红
前言
> 肾素-血管紧张素系统在高血压的发病机制中具有重要作用，临床研究发现高血压患者较正常血压者更易发生糖尿病，糖尿病患者发生高血压的危险性高于血压正常者，高血压和糖尿病患者常表现为胰岛素抵抗。
> 血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素1型(AT1)受体拮抗剂不仅能降低血压，而且能提高胰岛素的敏感性，提示血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与胰岛素抵抗之间具有相互作用。
前言
* AngII可以激活磷脂酶水解细胞膜磷脂并产生信号分子，在培养的平滑肌细胞5秒钟之内PLC被激活，水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)生成肌醇1，4，5-三磷酸 (inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油(diacyl glycerol, DG)。
* IP3和DG作为第二信使分别激动两个信号传递途径即IP3/Ca2+和DG/PKC通路，IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca2+释放，引起胞内Ca2+水平增加，从而启动胞内Ca2+信号系统，即通过依赖Ca2+、钙结合蛋白(如钙调素)的酶类活性变化来调节生理过程。
前言
* 然而，AngⅡ与胰岛素同时存在情况下对IP3和钙调素活性的影响目前尚不十分清楚。本文旨在探讨AngII和胰岛素对人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响。
材料和方法
* 人脐动脉平滑肌细胞培养和鉴定：采用组织贴块法，?-actin免疫组织化学检查细胞胞浆呈棕褐色鉴定为平滑肌细胞。
第2-3代细胞用于实验，用胰蛋白酶消化后接种于24孔培养板，浓度为2×106/ml。静置24小时后换成无血清细胞培养液，孵育24小时使细胞处于静止状态再进行实验。
实验分组：
* 对照组，为无血清的M1640培养液
* 不同浓度胰岛素组(10、100、1000mU/L)
* 不同浓度血管紧张素Ⅱ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)
* 不同浓度胰岛素(10、100、1000mU/L)+不同浓度AngⅡ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)
* 不同浓度AngⅡ组(0.1 nM、0.5nM、1nM)+不同浓度losartan组(1、5、10μM)
每组为6孔细胞。
检测方法：实验24小时后刮取细胞测定钙调素(CaM)和三磷酸肌醇(IP3)。
* 钙调素测定：采用磷酸二酯酶(PDE)法。
贴壁培养的人脐动脉平滑肌细胞，用预冷的PBS缓冲液洗3遍，用细胞刮将细胞刮下，制成细胞悬液，细胞数为2?106/ml。
加入50?lPDE混合液，混匀，30?C 预热10分钟。
加入100?l反应混合液，30?C水浴20分钟，煮沸1分钟。
立即放入冰水浴中，加入1mg/ml蛇毒50?l，混匀，放置30?C水浴中保温20分钟。
加入30% Dowex 400?l，混匀，1000转/分离心10分钟，取上清液200?l置于闪烁瓶中。
加入3ml无水乙醇和7ml闪烁液，于?液闪计数仪中测定cpm，根据标准曲线计算出钙调素含量。
* IP3测定：6孔板培养的平滑肌细胞，加入3H-肌醇 (10?Ci/孔，由中国原子能研究院标记)和不同浓度的胰岛素、AngⅡ和Losartan培养24小时。
弃去培养液，用预保温的反应缓冲液洗1次，弃去。
用2ml反应缓冲液37 ?C孵育10分钟，弃去，重复一次。
加入氯仿/甲醇/盐酸(1:2:0.25，V/V/V)1ml终止反应。
刮取细胞，收集细胞于离心管中，加入0.6ml氯仿/水(1:1，V/V)，振摇。
1000转/分离心5分钟，70?C水浴保温10分钟取出氯仿，收集水相层(约0.4ml)于柱中。
先后经过10ml双蒸水，10ml 60mM甲酸铵/5mM硼酸钠、10ml 0.2M甲酸铵/0.1M甲酸、10ml 0.7M甲酸铵/0.1M甲酸、10ml 1.05M甲酸铵/0.1M甲酸逐步洗脱。
流速3-4滴/分钟。
收集1.05M甲酸铵/0.1M甲酸过柱后含有IP3的洗脱液。
取2ml洗脱液于闪烁瓶中，60?C蒸发至残余液体约200?l，加入闪烁液和无水乙醇，?液闪仪计数，IP3以cpm/孔表示。
统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS10.0统计软件处理，多组间比较用方差分析，两两比较用q检验。p<0.05具有统计学差异。
结果
表1 胰岛素对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)
注：Insulin：胰岛素(单位：mU/L)。
表2 血管紧张素Ⅱ对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)
注：*与对照组相比p<0.05。AngⅡ：血管紧张素Ⅱ(单位：nM)。
表3 胰岛素和血管紧张素Ⅱ对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)
注：*与对照组相比p<0.05。Insulin：胰岛素(单位：mU/L)，AngⅡ：血管紧张素Ⅱ(单位：nM)。
表4Losartan对平滑肌细胞IP3和钙调素活性的影响(x±s, n=6)
注：AngII：血管紧张素Ⅱ(单位：nM)，losartan(单位：μM)。
讨论
本研究结果显示胰岛素对人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性无影响。
胰岛素主要通过2条信号转导途径发挥其生物学效应：PI3-K和MAPK途径。
胰岛素与胰岛素受体结合以后，使胰岛素受体的β亚基磷酸化，进一步使胰岛素受体底物(IRS)的酪氨酸磷酸化，IRS-1与PI3-K的调节亚基p85结合形成IRS-1/PI3-K复合物，使PIP2肌醇环上3位磷酸化，生成PI(3，4，5)P。
讨论
PIP3作为第二信使与含有SH2区段的信号蛋白结合，激活Akt，产生一系列生物学效应，如促进葡萄糖转运、糖原合成和刺激NO产生等。而激活MAPK途径与有丝分裂有关，如细胞生长和增生。
讨论
本文研究结果还显示AngⅡ使人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性增加，可以被Losartan阻断。Losartan是选择性AngII 1型受体(AT1)拮抗剂，说明AngⅡ引起上述病理改变是AT1受体介导的。
AngII与AT1结合，通过G蛋白介导，可以激活平滑肌细胞PLC，水解PIP2生成IP3 ，IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca2+释放，引起胞内Ca2+水平增加，从而启动胞内Ca2+信号系统，即通过依赖Ca2+、钙调素的酶类活性变化来调节生理过程。 Ca2+-钙调素激活肌球蛋白轻链，使肌球蛋白轻链磷酸化，在肌肉收缩中具有重要作用。
讨论
胰岛素和AngⅡ同时存在时，人脐动脉平滑肌细胞IP3和钙调素活性增加更为明显，可能与AngⅡ影响胰岛素信号转导，使胰岛素对PI3-K的激活作用减弱有关。
AngⅡ可以从多个水平影响胰岛素信号转导，如抑制IRS-1酪氨酸磷酸化、促进胰岛素受体β亚基或IRS-1丝氨酸磷酸化而抑制IRS-1对PI3-K的激活，使平滑肌细胞对胰岛素的敏感性下降，促进胰岛素抵抗的发生。
讨论
PIP2是PLC和PI3-K的共同底物，由于AngⅡ抑制了胰岛素对PI3-K的激活，故PIP2更多的被PLC水解为IP3，因此，胰岛素和AngⅡ同时存在时，平滑肌细胞IP3活性增加更为明显，IP3进一步激活Ca2+/钙调素系统(如图所示)。
讨论
AngⅡ Ins
(-)
AT1-R (-) IR
(-)
G蛋白IRS-1或IRS-2
PLCPI3-K
IP3PIP2 PIP3
(+)
Ca2+ Akt
(+)(+)
Ca2+/CaMNO
图: 胰岛素和血管紧张素Ⅱ信号转导途径之间的相互联系和相互影响
结论
综上所述，高浓度胰岛素对IP3和钙调素活性无影响，AngⅡ可以使IP3和钙调素活性升高，胰岛素和AngⅡ同时存在时培养的平滑肌细胞IP3和钙调素活性升高更为明显， AngII引起IP3和钙调素活性升高是AT1受体介导的。
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