细菌耐药及临床相关问题.ppt
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参见附件(943KB)。
主要内容
1、MRSA、 GISA、PRP、VRE
2、 产ESBLs株、 产AmpC酶株
? 抗生素前时代
? 抗生素时代之初
? 现在
? 抗生素后时代
? 减缓耐药菌株增长速度。
? 临床细菌工作者的作用不可低估!
? 呼吁各界，行动起来!
? 推迟抗生素后时代的到来!
耐药机理概况
耐药传播概况
- 交通手段的进步、旅游业兴起。
? 导致了多重耐药菌株在国际间传播。
? 也可在一个城市或一个地区内传播。
耐药株选择
一、关于SA
引言(一)
SA是医院及社区获得性感染最常见病原菌之一。
引言(二)
? 感染源：正常人、环境、食物等。
? 易感人群：免疫力低下者，包括婴幼儿、老年人、HIV、糖尿病、肾衰/肾透析、器官移植、药物滥用者。
? 携带状态是ICU患者感染的最危险因素。
引言(三)
在过去的50多年中：
? 化脓性链球菌一直保持对青霉素的敏感性。
? 而目前有95%以上的SA对青霉素耐药。
引言(四)
? SA的临床分离率呈逐年增加趋势。
? MRSA的问题最为严重。
? 它对抗生素呈多重耐药。
? 严重感染时需要动用万古霉素。
引言(五)
? 97年SA耐药性出现了新变化，即GISA出现。
? 临床治疗出现新问题。
? 犹如"雪上加霜"。
? 面对挑战、深入研究、广泛交流。
? 做到"知己知彼"。
SA耐药性变迁
SA耐药性变迁(一)
1942年 青霉素耐药
1961年 甲氧西林耐药(MRSA)
1997年 糖肽类低敏(GISA)
SA耐药性变迁(二)
? 对青霉素的耐药机制： 主要为?-内酰胺酶。
? 对青霉素耐药率增长趋势：
- 1944- 1945年：12% - 22%
- 50年代末：50%
- 1982年：90%
- 1997年：95%
SA耐药性变迁(三)
? 61年以后，欧洲陆续出现了MRSA。
? 70年代以后，MRSA感染遍及全球。
? 目前某些区域MRSA达90%以上。
SA耐药性变迁(七)
*MRSA 感染问题日趋严重。
* 肠球菌、难辨梭菌感染亦不断增多。
* 导致万古霉素用量不断增加。
* SA对万古敏感性减低，出现了GISA。
关于MRSA
关于MRSA(三)
MRSA的特点(一)
? 典型(大部分)MRSA为异质性(不均一)耐药，频率约为10-4 -10-8。
关于MRSA(四)
MRSA的特点(二)
? 耐药株一般生长缓慢。
? 耐药株在30℃，pH7.0，及高渗(NaCl)条件下可提高生长速度。
关于MRSA(五)
MRSA的特点(三)
? 多重耐药
关于GISA
I区
8-16ug/ml
关于GISA(一)
MRSA，肠球菌，难辩梭菌等
万古霉素用量增加
抗生素压力
万古霉素低敏株
关于GISA(二)
1997年日本首例报道了万古霉素中介度耐药的金葡菌，Mu50。随后美国报道了2例。
最初称为VISA
1998年CDC建议改为GISA
关于GISA(三)
1997年日本首例报道了GISA，Mu50(一)
? 1996年5月发现。
? 4个月的男婴，术后伤口发生MRSA感染。
? 万古霉素治疗29天。
? 万古霉素+Arbekacin治疗12天。
关于GISA(四)
1997年日本首例报道了GISA，Mu50(二)
? Arbekacin+Ampicillin/sulbactam治愈。
? 治疗过程中，自伤口多次得到MRSA。
? 万古霉素的MIC为8mg/L。
关于GISA(五)
1997年美国报道了2例GISA(一)
? 第1例分离自密执安州一名腹膜炎病人。
? 1996.1-6多次发生MRSA感染。
? 最初对万古霉素敏感。
? 反复利用万古霉素多种方式给药。
? 1997年7月分离出GISA。
? 对氯霉素、利福平、磺胺、四环素敏感。
关于GISA(六)
1997年美国报道了2例GISA(二)
? 第2例分离自新泽西州一名血液感染病人。
? 该病人长期携带MRSA及VRE。
? 自1997.2反复发生MRSA感染。
? 最初对万古霉素敏感。
? 3-8月间，一直用万古霉素治疗。
? 8月份，自血培养分离出一株GISA。
? 该GISA对庆大、磺胺及四环素敏感。
关于GISA(七)
GISA对万古的耐药机理尚不十分清楚：
? PCR证实Mu50不具有VanA、 VanB。
? Mu50有PBP及胞壁质单体前体增加。
? 电镜显示Mu50细胞壁增厚。
? 耐药可能与细胞壁合成增加有关。
关于GISA(八)
Hetero-GISA：
Hiramatsu报道Mu50后
调查日本国内Hetero-GISA
Mu3(自术后继发肺炎病人)
万古霉素治疗失败
关于GISA(九)
Hetero-GISA：
Mu3在含万古霉素的平板上
选择出不同耐药水平的亚群
在≥8mg/L平板上
选择出的亚群耐药水平与Mu50相当
关于GISA(十)
Hetero-GISA：
Mu3为典型的Hetero-GISA
MIC≥8mg/L的亚群发生频率为10-6
Hetero-GISA在日本较普遍
7家教学医院分离率为9.3%
某一医院高达20%
关于GISA(十一)
Hetero-GISA：
? 权威人士认为： Hetero-GISA可能是GISA的初级阶段。
? 万古霉素1991年刚刚进入日本。
? 1996年便出现了GISA。
? 可能与Hetero-GISA的普遍存在有关。
GISA 在美国的调查
检测数 金葡菌+ GISA+
密西根5421 (39%)0
新泽西123 39 (32%)0
纽约 45 16 (36%)0
CDC调查
? 用不同的琼脂平皿对33个医院筛查630株金葡菌,未发现VISA,只有2株异质性耐药株。
? NNIS系统每年从300多家医院接受7000例金葡菌医院感染的报道，VISA并不多见。
GISA的耐药机制
? 一.细胞壁增厚
? 金葡菌胞桨内的渗透压很高,拥有坚固的细胞壁是金葡菌能够在低渗环境中生长、繁殖的必要条件。由肽聚糖单体组成的肽聚糖链是金葡菌细胞壁的基本结构，相邻肽聚糖之间通过五肽支链相互交联形成致密的网状的肽聚糖层，约20层肽聚糖层构成完整的细胞壁。糖肽类抗生素通过结合金葡菌细胞桨表面肽聚糖单体上的D-丙氨酰-D-丙氨酸残基，从而抑制肽聚糖链的合成以及肽聚糖链间交联的形成，发挥抗菌作用。
? 目前临床分离的GISA菌株都存在细胞壁的明显增厚。日本学者用透视电子显微镜对来自7个国家分离的16株VISA进行观察，发现VISA细胞壁平均厚度为31.3nm,而VSSA细胞壁平均厚度仅为23.4nm,两者存在显著性差异.
? 当VISA对VA恢复敏感后,它们细胞壁的厚度降低且和VSSA无区别;再用VA对这些恢复敏感性的菌株进行选择,细菌对VA的敏感性又降至原先水平,同时出现细胞壁的增厚.
? GISA细胞壁增厚主要是因为肽聚糖层数的增多,其数量可达30-40层,远超过一般金葡菌的20层.
? 增多原因:一是过多合成肽聚糖,如Mu50株,其肽聚糖层数约为一般金葡菌的2倍;二是减少肽聚糖的脱落.新生的肽聚糖层在细胞桨膜表面产生并取代外层的旧肽聚糖层,最终使旧肽聚糖层从细菌表面脱落,而这一过程需要肽聚糖水解酶的参与.
? 从美国分离的一株VISA其肽聚糖水解酶活性显著降低,同时旧肽聚糖层脱落减少及细胞壁增厚,当其肽聚糖水解酶活性恢复正常时,细胞壁增厚随后减轻且对VA恢复敏感性.
? "亲合陷阱":
? 增厚细胞壁的肽聚糖层上有大量D-丙氨酰-D-丙氨酸残基,它们可与糖肽类抗生素结合,使大部分的药物分子结合在细胞壁上,而能够到达细胞桨膜表面与肽聚糖单体上的D-丙氨酰-D-丙氨酸残基结合的分子数大为减少,因此细菌不能被有效杀灭.
? "堵塞现象":
? 糖肽类抗生素分子首先与细菌最表面肽聚糖层上的D-丙氨酰-D-丙氨酸残基结合,而后堵塞肽聚糖层的网眼,使其网格结构被破坏,阻止药物向细胞内渗透并到达作用靶位.
? 二.肽聚糖链间交联减少
? 肽聚糖单体五肽支链上的谷氨酸残基未被酰胺化是导致肽聚糖链间交联减少的主要原因.
? 生长减慢
? VISA的生长速度明显慢于VSSA,美国CDC用细胞感受器微物理仪系统为手段,测量细菌生长时倍增时间的变化,作为细菌生长快慢的一个指标.通过将VISA与VSSA菌株及来自该中心的2株MRSA对照菌株相比较,发现VISA菌株生长速度明显减慢,其细胞数倍增时间是对照菌株的2倍.
? 抗生素的选择性压力与耐药性产生有关:
? 将5株不同地区的VISA菌株在不含糖肽类抗生素的培养基上连续传代,测定不同时间菌株的MIC,发现随培养代数的增加,5株VISA菌株的子代细菌对VA MIC值下降,最终回到敏感范围.将上述菌株在含低浓度VA的培养基上连续培养相同代后,发现子代细菌的MIC较VISA并无区别
GISA的耐药机制
? 试验证明不是从肠球菌转移来的 van 基因
? 不是由于小菌落变异株(而葡萄球菌对某些抗生素的耐药性可由小菌落引起)
? 对万古霉素敏感性的减少是诱导性的。其耐药性随持续暴露给亚致死剂量万古霉素而增长，随移走选择性压力而降低。
? 所以当前GISA分离株代表选出的突变体：
选择条件是：
- 体内过长时间暴露给万古霉素
MRSA检测应注意的几点(一)
? 温度
? 孵育时间
? 接种量(≤104CFU/ml容易漏检)
MRSA检测应注意的几点(二)
? 关注每一个细节。
? 漏检MRS可导致严重的治疗错误。
GISA检测方法(一)
? GISA的检测需要依赖定量药敏试验，并保证35℃，24h。
? NCCLS(2000)判定标准：
- MIC ≤ 4mg/L为GSSA
- MIC = 8-16mg/L为GISA
- MIC ≥ 32mg/L为GRSA
GISA检测方法(二)
? MICs测定方法较多，包括：
- 肉汤稀释法
- 琼脂稀释法
- Etest法
? 用6ug/ml万古霉素琼脂筛选既经济又简便，需要对照试验。
GISA检测方法(三)
? Hiramatsu等认为耐药性群体分析法在MRSA对万古霉素耐药性检测方面比肉汤稀释法更具指导性。
? 以Mu3为例，肉汤稀释法MIC为2ug/ml，群体分析法测出的某些亚群MIC 为5-9ug/ml。
GISA检测注意事项
? 如果MRSA感染，使用万古霉素效果不佳，则应进行MICs测试。
? MRSA感染，反复使用万古霉素时，应反复不断地对分离菌株进行万古霉素MICs测试。
万古霉素对7株金葡菌抑菌圈直径
即时结果与冷冻复苏后结果比较
GISA筛查过程
1840株SA
7株万古霉素直径≤14mm
P7865、R9778 (万古MIC=3?g/ml)
P7865在筛选过程中的MIC变化
? 这种不稳定性，使得临床上万古霉素能够对葡萄球菌保持高度的抗菌活性。
* 在1997年第一例GISA被发现后，有人认为除非研制出万古霉素的替代药，否则抗生素后时代将要到来。
Moellering RC Jr. Am J Med 1998, 104
* 许多国家在此领域进行了研究，对GISA有了更多的认识。
* 这种低水平耐药是诱导型耐药，随抗生素而产生，一旦离开抗生素，敏感性就会得到恢复。
* 这种不稳定性可能是耐药的主持调控基因尚未发生改变的缘故。
? 在一段时间内万古霉素对金葡菌仍会具有较高的活性。
? 耐药已见端倪、增强危机意识。
? 积极推荐替代药。
SA药敏试验选药建议
SA药敏选药建议(一)
1、B-内酰胺类：
● 常规只测青霉素及苯唑青霉素。......（后略) ......
主要内容
1、MRSA、 GISA、PRP、VRE
2、 产ESBLs株、 产AmpC酶株
? 抗生素前时代
? 抗生素时代之初
? 现在
? 抗生素后时代
? 减缓耐药菌株增长速度。
? 临床细菌工作者的作用不可低估!
? 呼吁各界，行动起来!
? 推迟抗生素后时代的到来!
耐药机理概况
耐药传播概况
- 交通手段的进步、旅游业兴起。
? 导致了多重耐药菌株在国际间传播。
? 也可在一个城市或一个地区内传播。
耐药株选择
一、关于SA
引言(一)
SA是医院及社区获得性感染最常见病原菌之一。
引言(二)
? 感染源：正常人、环境、食物等。
? 易感人群：免疫力低下者，包括婴幼儿、老年人、HIV、糖尿病、肾衰/肾透析、器官移植、药物滥用者。
? 携带状态是ICU患者感染的最危险因素。
引言(三)
在过去的50多年中：
? 化脓性链球菌一直保持对青霉素的敏感性。
? 而目前有95%以上的SA对青霉素耐药。
引言(四)
? SA的临床分离率呈逐年增加趋势。
? MRSA的问题最为严重。
? 它对抗生素呈多重耐药。
? 严重感染时需要动用万古霉素。
引言(五)
? 97年SA耐药性出现了新变化，即GISA出现。
? 临床治疗出现新问题。
? 犹如"雪上加霜"。
? 面对挑战、深入研究、广泛交流。
? 做到"知己知彼"。
SA耐药性变迁
SA耐药性变迁(一)
1942年 青霉素耐药
1961年 甲氧西林耐药(MRSA)
1997年 糖肽类低敏(GISA)
SA耐药性变迁(二)
? 对青霉素的耐药机制： 主要为?-内酰胺酶。
? 对青霉素耐药率增长趋势：
- 1944- 1945年：12% - 22%
- 50年代末：50%
- 1982年：90%
- 1997年：95%
SA耐药性变迁(三)
? 61年以后，欧洲陆续出现了MRSA。
? 70年代以后，MRSA感染遍及全球。
? 目前某些区域MRSA达90%以上。
SA耐药性变迁(七)
*MRSA 感染问题日趋严重。
* 肠球菌、难辨梭菌感染亦不断增多。
* 导致万古霉素用量不断增加。
* SA对万古敏感性减低，出现了GISA。
关于MRSA
关于MRSA(三)
MRSA的特点(一)
? 典型(大部分)MRSA为异质性(不均一)耐药，频率约为10-4 -10-8。
关于MRSA(四)
MRSA的特点(二)
? 耐药株一般生长缓慢。
? 耐药株在30℃，pH7.0，及高渗(NaCl)条件下可提高生长速度。
关于MRSA(五)
MRSA的特点(三)
? 多重耐药
关于GISA
I区
8-16ug/ml
关于GISA(一)
MRSA，肠球菌，难辩梭菌等
万古霉素用量增加
抗生素压力
万古霉素低敏株
关于GISA(二)
1997年日本首例报道了万古霉素中介度耐药的金葡菌，Mu50。随后美国报道了2例。
最初称为VISA
1998年CDC建议改为GISA
关于GISA(三)
1997年日本首例报道了GISA，Mu50(一)
? 1996年5月发现。
? 4个月的男婴，术后伤口发生MRSA感染。
? 万古霉素治疗29天。
? 万古霉素+Arbekacin治疗12天。
关于GISA(四)
1997年日本首例报道了GISA，Mu50(二)
? Arbekacin+Ampicillin/sulbactam治愈。
? 治疗过程中，自伤口多次得到MRSA。
? 万古霉素的MIC为8mg/L。
关于GISA(五)
1997年美国报道了2例GISA(一)
? 第1例分离自密执安州一名腹膜炎病人。
? 1996.1-6多次发生MRSA感染。
? 最初对万古霉素敏感。
? 反复利用万古霉素多种方式给药。
? 1997年7月分离出GISA。
? 对氯霉素、利福平、磺胺、四环素敏感。
关于GISA(六)
1997年美国报道了2例GISA(二)
? 第2例分离自新泽西州一名血液感染病人。
? 该病人长期携带MRSA及VRE。
? 自1997.2反复发生MRSA感染。
? 最初对万古霉素敏感。
? 3-8月间，一直用万古霉素治疗。
? 8月份，自血培养分离出一株GISA。
? 该GISA对庆大、磺胺及四环素敏感。
关于GISA(七)
GISA对万古的耐药机理尚不十分清楚：
? PCR证实Mu50不具有VanA、 VanB。
? Mu50有PBP及胞壁质单体前体增加。
? 电镜显示Mu50细胞壁增厚。
? 耐药可能与细胞壁合成增加有关。
关于GISA(八)
Hetero-GISA：
Hiramatsu报道Mu50后
调查日本国内Hetero-GISA
Mu3(自术后继发肺炎病人)
万古霉素治疗失败
关于GISA(九)
Hetero-GISA：
Mu3在含万古霉素的平板上
选择出不同耐药水平的亚群
在≥8mg/L平板上
选择出的亚群耐药水平与Mu50相当
关于GISA(十)
Hetero-GISA：
Mu3为典型的Hetero-GISA
MIC≥8mg/L的亚群发生频率为10-6
Hetero-GISA在日本较普遍
7家教学医院分离率为9.3%
某一医院高达20%
关于GISA(十一)
Hetero-GISA：
? 权威人士认为： Hetero-GISA可能是GISA的初级阶段。
? 万古霉素1991年刚刚进入日本。
? 1996年便出现了GISA。
? 可能与Hetero-GISA的普遍存在有关。
GISA 在美国的调查
检测数 金葡菌+ GISA+
密西根5421 (39%)0
新泽西123 39 (32%)0
纽约 45 16 (36%)0
CDC调查
? 用不同的琼脂平皿对33个医院筛查630株金葡菌,未发现VISA,只有2株异质性耐药株。
? NNIS系统每年从300多家医院接受7000例金葡菌医院感染的报道，VISA并不多见。
GISA的耐药机制
? 一.细胞壁增厚
? 金葡菌胞桨内的渗透压很高,拥有坚固的细胞壁是金葡菌能够在低渗环境中生长、繁殖的必要条件。由肽聚糖单体组成的肽聚糖链是金葡菌细胞壁的基本结构，相邻肽聚糖之间通过五肽支链相互交联形成致密的网状的肽聚糖层，约20层肽聚糖层构成完整的细胞壁。糖肽类抗生素通过结合金葡菌细胞桨表面肽聚糖单体上的D-丙氨酰-D-丙氨酸残基，从而抑制肽聚糖链的合成以及肽聚糖链间交联的形成，发挥抗菌作用。
? 目前临床分离的GISA菌株都存在细胞壁的明显增厚。日本学者用透视电子显微镜对来自7个国家分离的16株VISA进行观察，发现VISA细胞壁平均厚度为31.3nm,而VSSA细胞壁平均厚度仅为23.4nm,两者存在显著性差异.
? 当VISA对VA恢复敏感后,它们细胞壁的厚度降低且和VSSA无区别;再用VA对这些恢复敏感性的菌株进行选择,细菌对VA的敏感性又降至原先水平,同时出现细胞壁的增厚.
? GISA细胞壁增厚主要是因为肽聚糖层数的增多,其数量可达30-40层,远超过一般金葡菌的20层.
? 增多原因:一是过多合成肽聚糖,如Mu50株,其肽聚糖层数约为一般金葡菌的2倍;二是减少肽聚糖的脱落.新生的肽聚糖层在细胞桨膜表面产生并取代外层的旧肽聚糖层,最终使旧肽聚糖层从细菌表面脱落,而这一过程需要肽聚糖水解酶的参与.
? 从美国分离的一株VISA其肽聚糖水解酶活性显著降低,同时旧肽聚糖层脱落减少及细胞壁增厚,当其肽聚糖水解酶活性恢复正常时,细胞壁增厚随后减轻且对VA恢复敏感性.
? "亲合陷阱":
? 增厚细胞壁的肽聚糖层上有大量D-丙氨酰-D-丙氨酸残基,它们可与糖肽类抗生素结合,使大部分的药物分子结合在细胞壁上,而能够到达细胞桨膜表面与肽聚糖单体上的D-丙氨酰-D-丙氨酸残基结合的分子数大为减少,因此细菌不能被有效杀灭.
? "堵塞现象":
? 糖肽类抗生素分子首先与细菌最表面肽聚糖层上的D-丙氨酰-D-丙氨酸残基结合,而后堵塞肽聚糖层的网眼,使其网格结构被破坏,阻止药物向细胞内渗透并到达作用靶位.
? 二.肽聚糖链间交联减少
? 肽聚糖单体五肽支链上的谷氨酸残基未被酰胺化是导致肽聚糖链间交联减少的主要原因.
? 生长减慢
? VISA的生长速度明显慢于VSSA,美国CDC用细胞感受器微物理仪系统为手段,测量细菌生长时倍增时间的变化,作为细菌生长快慢的一个指标.通过将VISA与VSSA菌株及来自该中心的2株MRSA对照菌株相比较,发现VISA菌株生长速度明显减慢,其细胞数倍增时间是对照菌株的2倍.
? 抗生素的选择性压力与耐药性产生有关:
? 将5株不同地区的VISA菌株在不含糖肽类抗生素的培养基上连续传代,测定不同时间菌株的MIC,发现随培养代数的增加,5株VISA菌株的子代细菌对VA MIC值下降,最终回到敏感范围.将上述菌株在含低浓度VA的培养基上连续培养相同代后,发现子代细菌的MIC较VISA并无区别
GISA的耐药机制
? 试验证明不是从肠球菌转移来的 van 基因
? 不是由于小菌落变异株(而葡萄球菌对某些抗生素的耐药性可由小菌落引起)
? 对万古霉素敏感性的减少是诱导性的。其耐药性随持续暴露给亚致死剂量万古霉素而增长，随移走选择性压力而降低。
? 所以当前GISA分离株代表选出的突变体：
选择条件是：
- 体内过长时间暴露给万古霉素
MRSA检测应注意的几点(一)
? 温度
? 孵育时间
? 接种量(≤104CFU/ml容易漏检)
MRSA检测应注意的几点(二)
? 关注每一个细节。
? 漏检MRS可导致严重的治疗错误。
GISA检测方法(一)
? GISA的检测需要依赖定量药敏试验，并保证35℃，24h。
? NCCLS(2000)判定标准：
- MIC ≤ 4mg/L为GSSA
- MIC = 8-16mg/L为GISA
- MIC ≥ 32mg/L为GRSA
GISA检测方法(二)
? MICs测定方法较多，包括：
- 肉汤稀释法
- 琼脂稀释法
- Etest法
? 用6ug/ml万古霉素琼脂筛选既经济又简便，需要对照试验。
GISA检测方法(三)
? Hiramatsu等认为耐药性群体分析法在MRSA对万古霉素耐药性检测方面比肉汤稀释法更具指导性。
? 以Mu3为例，肉汤稀释法MIC为2ug/ml，群体分析法测出的某些亚群MIC 为5-9ug/ml。
GISA检测注意事项
? 如果MRSA感染，使用万古霉素效果不佳，则应进行MICs测试。
? MRSA感染，反复使用万古霉素时，应反复不断地对分离菌株进行万古霉素MICs测试。
万古霉素对7株金葡菌抑菌圈直径
即时结果与冷冻复苏后结果比较
GISA筛查过程
1840株SA
7株万古霉素直径≤14mm
P7865、R9778 (万古MIC=3?g/ml)
P7865在筛选过程中的MIC变化
? 这种不稳定性，使得临床上万古霉素能够对葡萄球菌保持高度的抗菌活性。
* 在1997年第一例GISA被发现后，有人认为除非研制出万古霉素的替代药，否则抗生素后时代将要到来。
Moellering RC Jr. Am J Med 1998, 104
* 许多国家在此领域进行了研究，对GISA有了更多的认识。
* 这种低水平耐药是诱导型耐药，随抗生素而产生，一旦离开抗生素，敏感性就会得到恢复。
* 这种不稳定性可能是耐药的主持调控基因尚未发生改变的缘故。
? 在一段时间内万古霉素对金葡菌仍会具有较高的活性。
? 耐药已见端倪、增强危机意识。
? 积极推荐替代药。
SA药敏试验选药建议
SA药敏选药建议(一)
1、B-内酰胺类：
● 常规只测青霉素及苯唑青霉素。......（后略) ......
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