蛋白质组学.ppt
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参见附件(1459KB)。
蛋白质组学及
相关技术简介
一. 蛋白质组学的兴起
二. 蛋白质组和蛋白质组学的概念
三. 蛋白质组学的研究内容
四. 蛋白质组研究的相关技术
一.蛋白质组学的兴起
(一)基因组计划的成就
1985年提出HGP
1986年宣布启动HGP
1989年建立了NCHGR
1990年正式启动HGP
1994年公布人类基因组全套遗传
连锁图
(A comprehensive human map
with centimorgan density
Science,1994,265:2049~2054)
1995年全基因组覆盖率高达94%的
物理图问世
(An STS based map of the
human genome Science,1995, 270:1945 ~ 1954 )
2000年宣告人类基因组序列草图测定
完成
2001年国际人类基因组计划机构与美
国 Celera公司分别在Nature、Science公布人类基因组草图
2001年2月15，16日公布人类基因组序列草图的同时，分别发表了"And now for the proteome" (Nature, 2001, 49:747 )、 "Proteomics in genomeland" (Science, 2001, 291:1221 )的述评与展望，将蛋白质组学的地位提高到前所未有的高度，认为是功能基因组学这一前沿研究的战略制高点。
截至2001年底75种生物的基因组全序列测定完成，其中：
古细菌 12个
细菌 57个
真核生物 9个
基因组比较：
肺支原体 8.1 × 105
E.coli 4.6 × 106
酿酒酵母1.2 × 107
线虫9.7 × 107
拟南芥1.2 × 108
果蝇1.4 × 108
(二)基因组计划的局限
? ORF尚未完全确立
? 基因表达具有时空特异性
? 蛋白质有其自身的活动规律
大规模、全方位的蛋白质研究势在必行。
(三)蛋白质组学是发现新药靶的
技术平台
蛋白质不仅是多种致病因子对机体作用的最重要的靶分子，并且也成为大多数药的靶标甚至直接的药物。
在20世纪90年代中期，全世界制药业用于寻找新药的药靶共483个，它们主要是蛋白质，其中受体占45%，酶占28%。而当时全世界正在使用的药物总数约是2000种，其中85%都是针对上述483种药靶。
可以说，功能基因组研究有可能带来一笔巨大的科学、经济财富。
(四)蛋白质组研究的开端
蛋白质组(proteome)一词由Marc Wilkins于1994年在意大利Siena的一次双向电泳会议上首次提出。
1995年，悉尼大学等4家实验室合作，对1种支原体进行了蛋白质成分的大规模的分离与鉴定，并在在文献中首次公开使用。
1996年 蛋白质组研究对象迅速扩展到单细胞真核生物及人体正常组织、病理标本等。
参与国家在1995年只有澳大利亚，而1997年已有美国等10个国家。国际著名学府哈佛等多个大学、研究所、实验室也跻身此类研究。
二. 蛋白质组和蛋白质组学的
概念
根据Wilkins等定义，"proteome"一词源于"PROTEin"与 "genOME"的组合，意指"一种基因组所表达的全套蛋白质"
Swinbanks则指出"proteome"代表一种生物的全套蛋白质。
Kahn P 则认为"proteome"反映不同细胞的不同蛋白质组合。
由此可见， "proteome"有三种不同的含义：1个基因组、1种生物或1种细胞/组织所表达的全套蛋白质。
蛋白质组学(proteomics)
是以蛋白质组为研究对象的新的研究领域，是功能基因组的重要支柱。
三.蛋白质组学的研究内容
蛋白质组学可分为两种：
表达蛋白质组学 (experession proteomics)
即把细胞、组织中的蛋白建立蛋白定量表达图谱。
该研究依赖双向电泳和图象分析技术，在整个蛋白质组水平上提供研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性。
细胞图谱蛋白质组学
(cell-map proteomics)
即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白质复合物组成等，来确定蛋白质间的相互作用。
蛋白质组学的前沿
大致分为3个方向：
1.针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织/细胞建立其蛋白质组或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群。
2.以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理/病理体系或过程的比较蛋白质组学研究。
3.蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究。
蛋白质组学的研究内容：
1. 蛋白质鉴定：
?一维或二维电泳
?western印迹
?蛋白质芯片
?抗体芯片
?免疫共沉淀
2.翻译后修饰：
如磷酸化、糖基化、酶原激活等。
3. 蛋白质功能确定：
?分析酶活性及确定酶底物
?细胞因子的生物学分析
?配体-受体分析
? 基因敲除
? RNA干扰
?基因突变
4. 分析蛋白质间相互作用：
细胞的生命过程并不仅是许多独立反应的总和，而是由许多蛋白质复合体执行并调控的。蛋白质间相互作用是细胞活动的基础和特征。
5. 研制新药：如寻找药物的靶分子，利用药物破坏蛋白质间的相互作用。
人类蛋白质组计划
2001年，国际人类蛋白质组组织(简称HUPO)成立，同时提出了"人类蛋白质组计划"(简称HPP)，蛋白质组研究已成为21世纪生命科学的焦点之一。
蛋白质组学集生物技术手段、分析技术、信息技术和材料技术等精华，采用了大规模、高通量、高速度的技术手段，通
过研究全部基因所表达的所有蛋白质在不同时间与空间的表达谱和功能谱，全景式地揭示生命活动的本质，特别是人体健康与疾病的机制。
蛋白质组是开发疾病防治诊治药物和技术的直接靶体库，人类蛋白质组已成为新世纪最大的战略资源之一，是国际生物科技的战略制高点。
"人类蛋白质组计划"是继"人类基因组计划"之后最大规模的国际性科技工程，也是21世纪第一个重大国际合作计划，其首批行动计划包括由美国牵头的"人类血浆蛋白质组计划"和由我国领军的"人类肝脏蛋白质组计划"(简称HLPP)。
美国继2000年9月启动"蛋白质结构启动计划"后，于2002年实施了"临床蛋白质组学计划"，以开发以蛋白质研究为基础的癌症诊断和治疗系统。蛋白质组学甚至已经形成了产业和市场。美国一家咨询公司的研究显示，到2005年这一市场将达到27亿多美元。
日本于2001年启动了蛋白质解析工程，并于2003年确定了"生物立国"战略，明确提出加快蛋白质组等方面的研发步伐。
韩国政府则明确计划五年内在生物、信息等6大技术领域投入77亿美元。
巴西、印度等发展中国家也不甘久居人后，投入大量资金用于基因组和蛋白质组的研究。
2003年12月15日，北京蛋白质组研究中心正式宣告成立，同时确定在北京中关村生命科学园建造研究中心大楼，建成后将成为国际人类肝脏蛋白质组计划的总部。2004年7月中旬，由中国科学家首次牵头的重大国际科学协作计划"人类肝脏蛋白质组计划"，在北京中关村生命园启动。
1998年，中国科学家就开始了肝脏蛋白质组的研究，并在国际蛋白质组第一次研讨会上倡导并提出了开展人类肝脏蛋白质组计划的建议。
2002年2月，1项由中国6名科学院院士领衔、100多名中青年科学家参与的以肝炎、肝癌、心血管病等疾病为研究对象的高科技研究正式启动。
国家重大科研项目，名为"人类重大疾病的蛋白质组学研究"是由军事医学科学院、中科院上海生命科学研究院、复旦大学等在中国蛋白质组学领域最具实力的14个科研院所和9个国家重点实验室等单位承担研究任务。
通过对蛋白质组学的不断研究，中国蛋白质组学基础和应用研究在国际同领域已经占有一席之地，终于获得了国际蛋白质组计划的主要项目--国际人类肝脏蛋白质组计划的领导权。
目前，由人类肝脏蛋白质组计划执行主席、中科院贺福初院士牵头、有16个国家和地区的80余个实验室参加的"人类肝脏蛋白质组计划"已经成为全球第一个人类组织与器官的蛋白组计划，也是我国第一次领导的重大国际协作计划。
人类肝脏蛋白质组计划的战略目标：
? 揭示并确认肝脏的蛋白质；
? 在蛋白质水平上全面注释与验证人
类基因组计划所预测的编码基因；
? 实现肝脏转录组、肝脏蛋白质组、血浆蛋白质组及人类基因组的对接
与整合；
? 揭示人类转录、翻译水平的整体、群
集调控规律；
? 建立肝脏"生理组"、"病理组"；
? 为重大肝病预防、诊断、治疗和新药
研发的突破提供重要的科学基础。
人类肝脏蛋白质组计划的科学目标 ：
? 构建蛋白质表达全谱和蛋白质修饰谱；
? 绘制蛋白质相互作用连锁图和细胞定位图；
? 建立符合国际标准的肝脏标本库、发展规模
化抗体制备技术并建立肝脏蛋白质抗体库、建立完整的肝脏蛋白质组数据库；
? 寻找药物作用靶点和探索肝脏疾病防治诊治
的新思路和新方案。
第三届国际人类蛋白组大会于2004年10月25号在北京开幕。各国科学家在此对人类基因组图进行"再解码"。
这次大会对人类蛋白组计划已经启动的6个主要计划进行了评价，包括人类血浆蛋白质组计划、人类肝脏蛋白质组计划、人类脑蛋白质组计划、大规模抗体计划、蛋白质组标准计划以及模式动物蛋白组计划。
贺福初，男，1962年5月出生，1982年9月入伍，1994年2月入党，现为中国科学院院士、军事医学科学院放射医学研究所所长、研究员、博士生导师，技术4级，大校军衔。
30岁被破格晋升为研究员，31岁担任实验血液学研究室主任和全军实验血液学重点实验室副主任，32岁担任博士生导师，36岁被任命为军事医学科学院放射医学研究所所长，39岁当选为全军最年轻的中科院院士。
四.蛋白质组研究的相关技术
1. 二维凝胶电泳
2. 质谱技术
3. 利用荧光染料进行定量
4. 蛋白质芯片技术
5. 酵母双杂交技术
6. 免疫共沉淀技术
7. 细胞共定位技术
(一) 二维凝胶电泳 (2-DE)
目前所应用的二维凝胶电泳体系是O?Farrell等首先于1975年发明。
原理:
根据蛋白质的两个一级属性即等电点(pI)和相对分子质量(Mr)的特异性，将蛋白质在第一方向上按照pI高低进行分离(等电聚焦)，在第二方向上按照相对分子质量大小进行分离(SDS-PAGE)。
由于电泳装置的限制和载体两性电解质的特性，使2-DE的重复性很差，很难制备大量重复性好的2-DE胶。
20世纪80年代初出现的固相pH梯度(IPG)等电聚焦电泳技术，使2-DE的重复性和上样量大大改善。
理论上的2-DE分辨能力可达到10000个点，目前已有实验室在30cm?40cm的大胶上获得这一分离效果。
2-DE存在问题：
? 膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白、高
分子量蛋白难以有效分离与检测；
? 重复性以及规模化和自动化有待与改
善。
一维等电聚焦 (IEF)
基本原理：
把蛋白质加入到pH 梯度的载体时，如果蛋白质所在点的pH值与其等电点不等，则该蛋白质会带上一定量的正或负电荷。此时如果外加一个强电场，蛋白质分子会在电场作用下向正极或负极移动。
凝胶制备：
早期以低浓度聚丙烯酰胺凝胶为介质，在外加电场时，连续排列着从正极到负极pI值逐渐增加的合成载体两性电解质(SCA)，从而形成了一个连续的pH 梯度。
固相pH梯度(IPG)是在immobilines试剂的基础上开发的。
Immobilines是拥有CH2=CH-CO - NH - R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，它们构成了分布在pH3-10范围不同值的缓冲体系。
IPG具有机械性能好、重复性好、易处理、上样量大的特点。
加样：
对于18cm的IPG胶条，上样量在100~150?g为宜，如果要进行考染或质谱分析、转膜分析时，制备胶上样量可从500 ?g ~几个mg。
运行：
IPG胶条的平衡: 需两个步骤
第一步平衡液的成分：
2%W/V SDS
20 mmol/L DTT
6mol/L 尿素
30% 甘油
第二步：用100 mmol/L 碘乙酰胺取代DTT。
二维SDS-PAGE
最常用的是laemmli非连续缓冲体系。
电泳缓冲液为Tris-Glycine-SDS系统。......（后略) ......
蛋白质组学及
相关技术简介
一. 蛋白质组学的兴起
二. 蛋白质组和蛋白质组学的概念
三. 蛋白质组学的研究内容
四. 蛋白质组研究的相关技术
一.蛋白质组学的兴起
(一)基因组计划的成就
1985年提出HGP
1986年宣布启动HGP
1989年建立了NCHGR
1990年正式启动HGP
1994年公布人类基因组全套遗传
连锁图
(A comprehensive human map
with centimorgan density
Science,1994,265:2049~2054)
1995年全基因组覆盖率高达94%的
物理图问世
(An STS based map of the
human genome Science,1995, 270:1945 ~ 1954 )
2000年宣告人类基因组序列草图测定
完成
2001年国际人类基因组计划机构与美
国 Celera公司分别在Nature、Science公布人类基因组草图
2001年2月15，16日公布人类基因组序列草图的同时，分别发表了"And now for the proteome" (Nature, 2001, 49:747 )、 "Proteomics in genomeland" (Science, 2001, 291:1221 )的述评与展望，将蛋白质组学的地位提高到前所未有的高度，认为是功能基因组学这一前沿研究的战略制高点。
截至2001年底75种生物的基因组全序列测定完成，其中：
古细菌 12个
细菌 57个
真核生物 9个
基因组比较：
肺支原体 8.1 × 105
E.coli 4.6 × 106
酿酒酵母1.2 × 107
线虫9.7 × 107
拟南芥1.2 × 108
果蝇1.4 × 108
(二)基因组计划的局限
? ORF尚未完全确立
? 基因表达具有时空特异性
? 蛋白质有其自身的活动规律
大规模、全方位的蛋白质研究势在必行。
(三)蛋白质组学是发现新药靶的
技术平台
蛋白质不仅是多种致病因子对机体作用的最重要的靶分子，并且也成为大多数药的靶标甚至直接的药物。
在20世纪90年代中期，全世界制药业用于寻找新药的药靶共483个，它们主要是蛋白质，其中受体占45%，酶占28%。而当时全世界正在使用的药物总数约是2000种，其中85%都是针对上述483种药靶。
可以说，功能基因组研究有可能带来一笔巨大的科学、经济财富。
(四)蛋白质组研究的开端
蛋白质组(proteome)一词由Marc Wilkins于1994年在意大利Siena的一次双向电泳会议上首次提出。
1995年，悉尼大学等4家实验室合作，对1种支原体进行了蛋白质成分的大规模的分离与鉴定，并在在文献中首次公开使用。
1996年 蛋白质组研究对象迅速扩展到单细胞真核生物及人体正常组织、病理标本等。
参与国家在1995年只有澳大利亚，而1997年已有美国等10个国家。国际著名学府哈佛等多个大学、研究所、实验室也跻身此类研究。
二. 蛋白质组和蛋白质组学的
概念
根据Wilkins等定义，"proteome"一词源于"PROTEin"与 "genOME"的组合，意指"一种基因组所表达的全套蛋白质"
Swinbanks则指出"proteome"代表一种生物的全套蛋白质。
Kahn P 则认为"proteome"反映不同细胞的不同蛋白质组合。
由此可见， "proteome"有三种不同的含义：1个基因组、1种生物或1种细胞/组织所表达的全套蛋白质。
蛋白质组学(proteomics)
是以蛋白质组为研究对象的新的研究领域，是功能基因组的重要支柱。
三.蛋白质组学的研究内容
蛋白质组学可分为两种：
表达蛋白质组学 (experession proteomics)
即把细胞、组织中的蛋白建立蛋白定量表达图谱。
该研究依赖双向电泳和图象分析技术，在整个蛋白质组水平上提供研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性。
细胞图谱蛋白质组学
(cell-map proteomics)
即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白质复合物组成等，来确定蛋白质间的相互作用。
蛋白质组学的前沿
大致分为3个方向：
1.针对有基因组或转录组数据库的生物体或组织/细胞建立其蛋白质组或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群。
2.以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理/病理体系或过程的比较蛋白质组学研究。
3.蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究。
蛋白质组学的研究内容：
1. 蛋白质鉴定：
?一维或二维电泳
?western印迹
?蛋白质芯片
?抗体芯片
?免疫共沉淀
2.翻译后修饰：
如磷酸化、糖基化、酶原激活等。
3. 蛋白质功能确定：
?分析酶活性及确定酶底物
?细胞因子的生物学分析
?配体-受体分析
? 基因敲除
? RNA干扰
?基因突变
4. 分析蛋白质间相互作用：
细胞的生命过程并不仅是许多独立反应的总和，而是由许多蛋白质复合体执行并调控的。蛋白质间相互作用是细胞活动的基础和特征。
5. 研制新药：如寻找药物的靶分子，利用药物破坏蛋白质间的相互作用。
人类蛋白质组计划
2001年，国际人类蛋白质组组织(简称HUPO)成立，同时提出了"人类蛋白质组计划"(简称HPP)，蛋白质组研究已成为21世纪生命科学的焦点之一。
蛋白质组学集生物技术手段、分析技术、信息技术和材料技术等精华，采用了大规模、高通量、高速度的技术手段，通
过研究全部基因所表达的所有蛋白质在不同时间与空间的表达谱和功能谱，全景式地揭示生命活动的本质，特别是人体健康与疾病的机制。
蛋白质组是开发疾病防治诊治药物和技术的直接靶体库，人类蛋白质组已成为新世纪最大的战略资源之一，是国际生物科技的战略制高点。
"人类蛋白质组计划"是继"人类基因组计划"之后最大规模的国际性科技工程，也是21世纪第一个重大国际合作计划，其首批行动计划包括由美国牵头的"人类血浆蛋白质组计划"和由我国领军的"人类肝脏蛋白质组计划"(简称HLPP)。
美国继2000年9月启动"蛋白质结构启动计划"后，于2002年实施了"临床蛋白质组学计划"，以开发以蛋白质研究为基础的癌症诊断和治疗系统。蛋白质组学甚至已经形成了产业和市场。美国一家咨询公司的研究显示，到2005年这一市场将达到27亿多美元。
日本于2001年启动了蛋白质解析工程，并于2003年确定了"生物立国"战略，明确提出加快蛋白质组等方面的研发步伐。
韩国政府则明确计划五年内在生物、信息等6大技术领域投入77亿美元。
巴西、印度等发展中国家也不甘久居人后，投入大量资金用于基因组和蛋白质组的研究。
2003年12月15日，北京蛋白质组研究中心正式宣告成立，同时确定在北京中关村生命科学园建造研究中心大楼，建成后将成为国际人类肝脏蛋白质组计划的总部。2004年7月中旬，由中国科学家首次牵头的重大国际科学协作计划"人类肝脏蛋白质组计划"，在北京中关村生命园启动。
1998年，中国科学家就开始了肝脏蛋白质组的研究，并在国际蛋白质组第一次研讨会上倡导并提出了开展人类肝脏蛋白质组计划的建议。
2002年2月，1项由中国6名科学院院士领衔、100多名中青年科学家参与的以肝炎、肝癌、心血管病等疾病为研究对象的高科技研究正式启动。
国家重大科研项目，名为"人类重大疾病的蛋白质组学研究"是由军事医学科学院、中科院上海生命科学研究院、复旦大学等在中国蛋白质组学领域最具实力的14个科研院所和9个国家重点实验室等单位承担研究任务。
通过对蛋白质组学的不断研究，中国蛋白质组学基础和应用研究在国际同领域已经占有一席之地，终于获得了国际蛋白质组计划的主要项目--国际人类肝脏蛋白质组计划的领导权。
目前，由人类肝脏蛋白质组计划执行主席、中科院贺福初院士牵头、有16个国家和地区的80余个实验室参加的"人类肝脏蛋白质组计划"已经成为全球第一个人类组织与器官的蛋白组计划，也是我国第一次领导的重大国际协作计划。
人类肝脏蛋白质组计划的战略目标：
? 揭示并确认肝脏的蛋白质；
? 在蛋白质水平上全面注释与验证人
类基因组计划所预测的编码基因；
? 实现肝脏转录组、肝脏蛋白质组、血浆蛋白质组及人类基因组的对接
与整合；
? 揭示人类转录、翻译水平的整体、群
集调控规律；
? 建立肝脏"生理组"、"病理组"；
? 为重大肝病预防、诊断、治疗和新药
研发的突破提供重要的科学基础。
人类肝脏蛋白质组计划的科学目标 ：
? 构建蛋白质表达全谱和蛋白质修饰谱；
? 绘制蛋白质相互作用连锁图和细胞定位图；
? 建立符合国际标准的肝脏标本库、发展规模
化抗体制备技术并建立肝脏蛋白质抗体库、建立完整的肝脏蛋白质组数据库；
? 寻找药物作用靶点和探索肝脏疾病防治诊治
的新思路和新方案。
第三届国际人类蛋白组大会于2004年10月25号在北京开幕。各国科学家在此对人类基因组图进行"再解码"。
这次大会对人类蛋白组计划已经启动的6个主要计划进行了评价，包括人类血浆蛋白质组计划、人类肝脏蛋白质组计划、人类脑蛋白质组计划、大规模抗体计划、蛋白质组标准计划以及模式动物蛋白组计划。
贺福初，男，1962年5月出生，1982年9月入伍，1994年2月入党，现为中国科学院院士、军事医学科学院放射医学研究所所长、研究员、博士生导师，技术4级，大校军衔。
30岁被破格晋升为研究员，31岁担任实验血液学研究室主任和全军实验血液学重点实验室副主任，32岁担任博士生导师，36岁被任命为军事医学科学院放射医学研究所所长，39岁当选为全军最年轻的中科院院士。
四.蛋白质组研究的相关技术
1. 二维凝胶电泳
2. 质谱技术
3. 利用荧光染料进行定量
4. 蛋白质芯片技术
5. 酵母双杂交技术
6. 免疫共沉淀技术
7. 细胞共定位技术
(一) 二维凝胶电泳 (2-DE)
目前所应用的二维凝胶电泳体系是O?Farrell等首先于1975年发明。
原理:
根据蛋白质的两个一级属性即等电点(pI)和相对分子质量(Mr)的特异性，将蛋白质在第一方向上按照pI高低进行分离(等电聚焦)，在第二方向上按照相对分子质量大小进行分离(SDS-PAGE)。
由于电泳装置的限制和载体两性电解质的特性，使2-DE的重复性很差，很难制备大量重复性好的2-DE胶。
20世纪80年代初出现的固相pH梯度(IPG)等电聚焦电泳技术，使2-DE的重复性和上样量大大改善。
理论上的2-DE分辨能力可达到10000个点，目前已有实验室在30cm?40cm的大胶上获得这一分离效果。
2-DE存在问题：
? 膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白、高
分子量蛋白难以有效分离与检测；
? 重复性以及规模化和自动化有待与改
善。
一维等电聚焦 (IEF)
基本原理：
把蛋白质加入到pH 梯度的载体时，如果蛋白质所在点的pH值与其等电点不等，则该蛋白质会带上一定量的正或负电荷。此时如果外加一个强电场，蛋白质分子会在电场作用下向正极或负极移动。
凝胶制备：
早期以低浓度聚丙烯酰胺凝胶为介质，在外加电场时，连续排列着从正极到负极pI值逐渐增加的合成载体两性电解质(SCA)，从而形成了一个连续的pH 梯度。
固相pH梯度(IPG)是在immobilines试剂的基础上开发的。
Immobilines是拥有CH2=CH-CO - NH - R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，它们构成了分布在pH3-10范围不同值的缓冲体系。
IPG具有机械性能好、重复性好、易处理、上样量大的特点。
加样：
对于18cm的IPG胶条，上样量在100~150?g为宜，如果要进行考染或质谱分析、转膜分析时，制备胶上样量可从500 ?g ~几个mg。
运行：
IPG胶条的平衡: 需两个步骤
第一步平衡液的成分：
2%W/V SDS
20 mmol/L DTT
6mol/L 尿素
30% 甘油
第二步：用100 mmol/L 碘乙酰胺取代DTT。
二维SDS-PAGE
最常用的是laemmli非连续缓冲体系。
电泳缓冲液为Tris-Glycine-SDS系统。......（后略) ......
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