反义治疗与白血病靶基因研究进展.ppt
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参见附件(53KB)。
反义治疗与白血病
靶基因研究进展
郑州大学一附院血液科
孙 玲
反义治疗是根据碱基互补的原理，利用与目标靶基因DNA 或RNA互补的寡核苷酸片段封闭基因的表达，达到治疗目的。
反义技术用于抗白血病的理论基础是用反义寡核苷酸片段中止原癌基因和癌基因的表达，使白血病细胞向成熟分化或诱导凋亡，从基因水平起到缓解白血病作用。
反义治疗的优点：
1.特异性强，对正常细胞无明显影响。
? 反义治疗是在核酸水平，优于蛋白质水平的治疗。
反义治疗的基本内容主要包括反义RNA 、反义 DNA 及核酶，目前研究较多的是反义寡核苷酸(ODN)和反义寡脱氧核苷酸(D-ODN) 。
反义治疗的作用机制：
1、与双链DNA形成三链结构，使
DNA转录受阻。
2、结合靶mRNA，与其形成双链
结构，激活核酶，降解靶mRNA，使其翻译中止。
3、使细胞表达核酶，降解特定的
基因片段。
4、阻止mRNA前体由胞核向胞浆
转运，间接影响基因的表达。
反义药物的必备条件：
1、可人工合成。
2、能通过细胞膜进入靶细胞，在细
胞内形成一定浓度。
3、在靶细胞内滞留并具有较长的半
衰期。
4、具有对抗血浆，体液和细胞内
核酶的降解作用。
5、能特异识别靶序列，并与之结
合。
反义治疗的靶基因
包括融合基因
点突变基因
正常基因
扩增基因
1、融合基因: bcr/abl基因
CML细胞遗传学的特征性改变是细胞内存在ph染色体。
Ph染色体的分子学改变是9号染色体的 c-abl基因与22号染色体的bcr 基因形成bcr/abl融合基因，产生P210蛋白。
P210蛋白比由单纯c-abl基因产生的P145蛋白具有更强的酪氨酸激酶活性，使细胞产生强烈的抗凋亡作用，诱导CML的发生。
bcr/abl融合基因对CML是特异的，且比较稳定，理论上可以作为反义治疗较为理想的靶基因。
1991 年,Szczylik.首先报导针对bcr/abl融合基因的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide ASON)可以选择性抑制CML病人Ph+细胞的增殖。至今已有大量类似报导。关于反义治疗的机制有以下几种学说。
(1)诱导凋亡作用
目前普遍认为bcr/abl基因具有强烈的抗凋亡作用。反义寡核苷酸作用在于诱导细胞凋亡的发生。
( 2)恢复正常细胞间的黏附作用
正常细胞可以通过?整合素及其受体等黏附分子的信号传导对造血细胞的增殖分化以及从骨髓释放到外周血有重要的调节作用。
由bcr/abl基因产生的P210蛋白与一系列骨架蛋白相互作用，影响?-整合素及受体。导致CML祖细胞与造血微环境基质及纤维结合素黏附减少，向恶性增殖分化并进入外周血。
应用bcr/abl反义寡核苷酸可以有效阻止这种病理过程。恢复造血细胞的正常黏附及?-整合素的抑制增殖作用。
(3)非反义机制
有人对反义寡核苷酸完全通过反义机制起作用有争议。他们认为反义核酸可能也通过与某些蛋白如酪氨酸激酶，DNA聚合酶和某些内切酶起作用。
Vaerman认为是寡核苷酸3`末端TAT特殊序列决定寡核苷酸的抑制增殖作用。
CML细胞经bcr/abl反义寡核苷酸处理后生长受抑，对正常细胞无影响。人们已开始用于CML自体骨髓移植的体外净化。
也有人提出，CML 为克隆性疾病，但bcr/abl在CML干细胞中无表达，因此bcr/abl是不是CML真正的致病基因有待探讨。
2、点突变
P53 基因定位于17P13·1区，是一种抑癌基因，分野生型和突变型。突变型常常是野生型发生突变所致，它不具备抗细胞增殖作用，与肿瘤的发生有关。合成与突变型P53互补的ASON可能抑制白血病细胞的增殖。
其抑制白血病细胞增殖作用主要依赖于导致DNA的急性损伤。体外实验证实，这种突变型的ASON与蒽环类药物有协同作用，可以提高疗效。
3、正常基因
(1)c-myb基因定位于6号染色
体, 编码75KD核结合蛋白, 是
细胞周期中G/S期重要的转换
基因。
c-myb参与正常造血，具有
调控多种造血祖细胞的功能
尤其对晚期造血祖细胞更重
要。
?
c-myb 在白血病细胞系(如K562细胞系)中常过度表达，推测与白血病发生有相关性。研究显示，c-mybASON通过抑制c-myb表达，抑制白血病细胞增殖。
c-mybASON抑制白血病细胞增殖可能与G/S期阻滞有关。
此外，c-myb能够调控bcr/abl融合基因的表达，c-myb与bcr/abl联合应用可能提高CML反义治疗水平。
(2) c-myc基因的蛋白产物是一种
DNA结合蛋白，是调节正常细
胞生长、分化重要的转录因子。
c-myc基因表达是细胞分裂进入
S期所必需的。但c-myc基因的
表达失控在恶性肿瘤发生中起关
键用。
研究表明， c-myc基因在髓系白血病细胞系(HL-60)中呈高表达，并抑制细胞的分化和凋亡。 c-myc反义核酸能抑制HL60细胞的增殖，促进分化，对正常细胞无抑制作用。从而证明了c-myc反义核酸作为药物治疗白血病的可能性。
3、端粒酶反义寡核苷酸
端粒位于染色体末端，随细胞分裂而缩短，最终导致细胞凋亡。
端粒酶是一种逆转录酶，能以自身RNA为模板，合成TTAGGG重复序列的端粒蛋白，维持端粒长度，使细胞永生化，故在肿瘤发生和发展中起重要作用。
研究证实，绝大多数肿瘤和白血病细胞端粒酶活性明显增高，认为端粒酶活性与白血病发生密切相关，故应用端粒酶反义核酸抑制白血病细胞生长成为治疗白血病的新策略。
由于正常细胞端粒酶活性低表达或不表达，因此端粒酶反义核酸对正常细胞影响较小。
端粒酶由三部分组成：端粒酶RNA模板(hRT)、端粒酶逆转录酶(hTERT)和端粒酶相关蛋白。
目前研究的端粒酶抑制剂主要针对hRT和hTERT两部分设计的，研究表明，两部分的反义寡核苷酸对白血病细胞的增殖都有抑制作用。
4、扩增基因
反义治疗的靶基因，还包括因扩增而过度表达的基因。研究较多的是bcl-2及多药耐基因mdr-1。
(1)bcl-2基因
bcl-2是一种抗凋亡的原癌基因，定位于18q21。它编码一种26KD的线粒体膜蛋白。 bcl-2能抑制造血细胞因热、射线、化学药物等多种因素引起的细胞凋亡。还可以通过蛋白激酶 C磷酸化作用产生多药耐药性。
研究显示：应用bcl-2ASON可使白血病细胞中bcl-2表达下降，增强其对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的促凋亡作用。
(2)mdr-1基因
多耐药基因mdr-1 过度表达是多耐药产生的主要机制，也是白血病化疗失败的主要原因之一。
mdr-1编码P-170糖蛋白，能够把多种结构、作用机制不同的化疗药物从细胞内泵到细胞外，使细胞内药物浓度降低，产生耐药性。
mdr-1ASON可以抑制P170糖蛋白的表达，增强耐药的白血病细胞对化疗药物的敏感性，从而起到逆转耐药的作用。
反义治疗所面临的问题
以上列举的常见癌基因的反义治疗在体外及动物试验均能明显抑制癌基因的表达，但广泛应用临床还需要一定的时间进一步完善技术和进一步的临床试验。目前面临主要问题有以下几个方面：
1、ASON在胞浆中易被核酸降解，半衰期短、稳定性差。常用化学修饰法增强其稳定性。但目前的多种修饰法都不能维持其足够的稳定性。在这方面还需进一步改进。
2、ASON合成成本昂贵，还不能
广泛 用于临床。
3、白血病发病过程复杂，多个癌基因同时存在或在不同阶段促进白血病向恶性转化。因此抑制单个基因
常不能完全逆转白血病的发生过程，反义技术针对多个基因联合应用，有望提高白血病治疗疗效，目前这方面研究正在进行中。
结语
目前公认，无限制增加细胞毒药物用量不是肿瘤治疗方向。虽然反义技术应用于临床还有一定的困难，随着人们对白血病发病机制的深入了解和基因工程技术的不断完善，将会发现更多新的基因，新的基因靶点也会越来越多，这些新技术将会日趋成熟，为反义治疗带来更广阔的应用前景，为人类战胜白血病开辟一条崭新的途径。
谢 谢
反义治疗与白血病
靶基因研究进展
郑州大学一附院血液科
孙 玲
反义治疗是根据碱基互补的原理，利用与目标靶基因DNA 或RNA互补的寡核苷酸片段封闭基因的表达，达到治疗目的。
反义技术用于抗白血病的理论基础是用反义寡核苷酸片段中止原癌基因和癌基因的表达，使白血病细胞向成熟分化或诱导凋亡，从基因水平起到缓解白血病作用。
反义治疗的优点：
1.特异性强，对正常细胞无明显影响。
? 反义治疗是在核酸水平，优于蛋白质水平的治疗。
反义治疗的基本内容主要包括反义RNA 、反义 DNA 及核酶，目前研究较多的是反义寡核苷酸(ODN)和反义寡脱氧核苷酸(D-ODN) 。
反义治疗的作用机制：
1、与双链DNA形成三链结构，使
DNA转录受阻。
2、结合靶mRNA，与其形成双链
结构，激活核酶，降解靶mRNA，使其翻译中止。
3、使细胞表达核酶，降解特定的
基因片段。
4、阻止mRNA前体由胞核向胞浆
转运，间接影响基因的表达。
反义药物的必备条件：
1、可人工合成。
2、能通过细胞膜进入靶细胞，在细
胞内形成一定浓度。
3、在靶细胞内滞留并具有较长的半
衰期。
4、具有对抗血浆，体液和细胞内
核酶的降解作用。
5、能特异识别靶序列，并与之结
合。
反义治疗的靶基因
包括融合基因
点突变基因
正常基因
扩增基因
1、融合基因: bcr/abl基因
CML细胞遗传学的特征性改变是细胞内存在ph染色体。
Ph染色体的分子学改变是9号染色体的 c-abl基因与22号染色体的bcr 基因形成bcr/abl融合基因，产生P210蛋白。
P210蛋白比由单纯c-abl基因产生的P145蛋白具有更强的酪氨酸激酶活性，使细胞产生强烈的抗凋亡作用，诱导CML的发生。
bcr/abl融合基因对CML是特异的，且比较稳定，理论上可以作为反义治疗较为理想的靶基因。
1991 年,Szczylik.首先报导针对bcr/abl融合基因的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide ASON)可以选择性抑制CML病人Ph+细胞的增殖。至今已有大量类似报导。关于反义治疗的机制有以下几种学说。
(1)诱导凋亡作用
目前普遍认为bcr/abl基因具有强烈的抗凋亡作用。反义寡核苷酸作用在于诱导细胞凋亡的发生。
( 2)恢复正常细胞间的黏附作用
正常细胞可以通过?整合素及其受体等黏附分子的信号传导对造血细胞的增殖分化以及从骨髓释放到外周血有重要的调节作用。
由bcr/abl基因产生的P210蛋白与一系列骨架蛋白相互作用，影响?-整合素及受体。导致CML祖细胞与造血微环境基质及纤维结合素黏附减少，向恶性增殖分化并进入外周血。
应用bcr/abl反义寡核苷酸可以有效阻止这种病理过程。恢复造血细胞的正常黏附及?-整合素的抑制增殖作用。
(3)非反义机制
有人对反义寡核苷酸完全通过反义机制起作用有争议。他们认为反义核酸可能也通过与某些蛋白如酪氨酸激酶，DNA聚合酶和某些内切酶起作用。
Vaerman认为是寡核苷酸3`末端TAT特殊序列决定寡核苷酸的抑制增殖作用。
CML细胞经bcr/abl反义寡核苷酸处理后生长受抑，对正常细胞无影响。人们已开始用于CML自体骨髓移植的体外净化。
也有人提出，CML 为克隆性疾病，但bcr/abl在CML干细胞中无表达，因此bcr/abl是不是CML真正的致病基因有待探讨。
2、点突变
P53 基因定位于17P13·1区，是一种抑癌基因，分野生型和突变型。突变型常常是野生型发生突变所致，它不具备抗细胞增殖作用，与肿瘤的发生有关。合成与突变型P53互补的ASON可能抑制白血病细胞的增殖。
其抑制白血病细胞增殖作用主要依赖于导致DNA的急性损伤。体外实验证实，这种突变型的ASON与蒽环类药物有协同作用，可以提高疗效。
3、正常基因
(1)c-myb基因定位于6号染色
体, 编码75KD核结合蛋白, 是
细胞周期中G/S期重要的转换
基因。
c-myb参与正常造血，具有
调控多种造血祖细胞的功能
尤其对晚期造血祖细胞更重
要。
?
c-myb 在白血病细胞系(如K562细胞系)中常过度表达，推测与白血病发生有相关性。研究显示，c-mybASON通过抑制c-myb表达，抑制白血病细胞增殖。
c-mybASON抑制白血病细胞增殖可能与G/S期阻滞有关。
此外，c-myb能够调控bcr/abl融合基因的表达，c-myb与bcr/abl联合应用可能提高CML反义治疗水平。
(2) c-myc基因的蛋白产物是一种
DNA结合蛋白，是调节正常细
胞生长、分化重要的转录因子。
c-myc基因表达是细胞分裂进入
S期所必需的。但c-myc基因的
表达失控在恶性肿瘤发生中起关
键用。
研究表明， c-myc基因在髓系白血病细胞系(HL-60)中呈高表达，并抑制细胞的分化和凋亡。 c-myc反义核酸能抑制HL60细胞的增殖，促进分化，对正常细胞无抑制作用。从而证明了c-myc反义核酸作为药物治疗白血病的可能性。
3、端粒酶反义寡核苷酸
端粒位于染色体末端，随细胞分裂而缩短，最终导致细胞凋亡。
端粒酶是一种逆转录酶，能以自身RNA为模板，合成TTAGGG重复序列的端粒蛋白，维持端粒长度，使细胞永生化，故在肿瘤发生和发展中起重要作用。
研究证实，绝大多数肿瘤和白血病细胞端粒酶活性明显增高，认为端粒酶活性与白血病发生密切相关，故应用端粒酶反义核酸抑制白血病细胞生长成为治疗白血病的新策略。
由于正常细胞端粒酶活性低表达或不表达，因此端粒酶反义核酸对正常细胞影响较小。
端粒酶由三部分组成：端粒酶RNA模板(hRT)、端粒酶逆转录酶(hTERT)和端粒酶相关蛋白。
目前研究的端粒酶抑制剂主要针对hRT和hTERT两部分设计的，研究表明，两部分的反义寡核苷酸对白血病细胞的增殖都有抑制作用。
4、扩增基因
反义治疗的靶基因，还包括因扩增而过度表达的基因。研究较多的是bcl-2及多药耐基因mdr-1。
(1)bcl-2基因
bcl-2是一种抗凋亡的原癌基因，定位于18q21。它编码一种26KD的线粒体膜蛋白。 bcl-2能抑制造血细胞因热、射线、化学药物等多种因素引起的细胞凋亡。还可以通过蛋白激酶 C磷酸化作用产生多药耐药性。
研究显示：应用bcl-2ASON可使白血病细胞中bcl-2表达下降，增强其对化疗药物的敏感性，增强化疗药物的促凋亡作用。
(2)mdr-1基因
多耐药基因mdr-1 过度表达是多耐药产生的主要机制，也是白血病化疗失败的主要原因之一。
mdr-1编码P-170糖蛋白，能够把多种结构、作用机制不同的化疗药物从细胞内泵到细胞外，使细胞内药物浓度降低，产生耐药性。
mdr-1ASON可以抑制P170糖蛋白的表达，增强耐药的白血病细胞对化疗药物的敏感性，从而起到逆转耐药的作用。
反义治疗所面临的问题
以上列举的常见癌基因的反义治疗在体外及动物试验均能明显抑制癌基因的表达，但广泛应用临床还需要一定的时间进一步完善技术和进一步的临床试验。目前面临主要问题有以下几个方面：
1、ASON在胞浆中易被核酸降解，半衰期短、稳定性差。常用化学修饰法增强其稳定性。但目前的多种修饰法都不能维持其足够的稳定性。在这方面还需进一步改进。
2、ASON合成成本昂贵，还不能
广泛 用于临床。
3、白血病发病过程复杂，多个癌基因同时存在或在不同阶段促进白血病向恶性转化。因此抑制单个基因
常不能完全逆转白血病的发生过程，反义技术针对多个基因联合应用，有望提高白血病治疗疗效，目前这方面研究正在进行中。
结语
目前公认，无限制增加细胞毒药物用量不是肿瘤治疗方向。虽然反义技术应用于临床还有一定的困难，随着人们对白血病发病机制的深入了解和基因工程技术的不断完善，将会发现更多新的基因，新的基因靶点也会越来越多，这些新技术将会日趋成熟，为反义治疗带来更广阔的应用前景，为人类战胜白血病开辟一条崭新的途径。
谢 谢
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