中药联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期及细胞增殖抗原的影响
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中药联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期及细胞增殖抗原的影响
广州中医药大学第二临床医学院肿瘤科吴万垠*柴小姝刘伟胜
摘要： 目的揭示中药消积饮、华蟾素联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期的作用机制。方法将90只皮下接种Lewis肺癌细胞的C57BL/6小鼠随机分成生理盐水阴性对照组(NS)、环磷酰胺治疗对照组(CTX)、消积饮组(XJY)、华蟾素组(HCS) 、长春瑞滨组(NVB)及其相应的组合(XH、XN、HN与XHN)，每组10只。给药7天后处死小鼠，比较各组小鼠的皮下瘤重，计算抑瘤率。运用FCM分析小鼠肿瘤细胞周期各时相分布的状况，并利用IHC计算PCNA阳性标记指数(PCNA-LI.%)。结果各治疗组瘤重较NS组低(p<0.01)，抑瘤率分别是32.28%、44.44%、48.68%、51.32%、57.14%、58.73%、64.55%。XJY组的G0/G1期肿瘤细胞较生理盐水组比例增高(p<0.01)，HCS组的肿瘤细胞阻滞于S期，较生理盐水组比例增高(p<0.01)，NVB组的肿瘤细胞G2/M期细胞较生理盐水组比例增高(p<0.01)；XJY+HCS的肿瘤细胞G0/G1期、S期细胞比例较NS组均有所增高(p<0.01)，XJY+NVB的肿瘤细胞G0/G1期、G2/M期细胞比例较NS组均有所增高(p<0.01)，HCS+NVB的肿瘤细胞S期、G2/M期细胞比例较NS组略高(p>0.05)；XJY+HCS+NVB的肿瘤细胞G0/G1期细胞比例较其余所有组增高(p<0.01)。XJY+HCS+NVB组的G0/G1期细胞与XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组比较，统计学分析具有差异(p<0.05)。XJY、HCS、NVB、XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB、XJY+HCS+NVB组的PCNA-LI均低于NS组(p<0.01)。XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组的PCNA-LI均低于XJY、HCS、NVB(p<0.01)。XJY+HCS+NVB组的PCNA-LI低于XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组(p<0.05)。结论消积饮、华蟾素和长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌具有协同抑制肺癌细胞增殖作用，两药联合作用优于单药，三药联合作用优于单药及两药作用。其作用机理可能与协同作用于不同细胞周期有关。
关键词：中药；长春瑞滨；Lewis肺癌；细胞周期；细胞增殖抗原
中药可对肺癌细胞周期中不同时相的细胞具有杀伤作用，阻滞或延缓细胞周期中某一点或某一部分，从而导致细胞增殖的减慢或停止，达到杀灭肺癌细胞的目的，联合使用抗癌药物的原则为选择阻滞细胞周期不同时相的抗癌药物，以尽可能达到对细胞周期各时相都具有阻抑作用，最终达到最大限度的杀灭肿瘤细胞。新药长春瑞滨属于细胞周期特异性药物，可作用于肿瘤细胞G2期而抑制肿瘤生长。消积饮口服液是广东省名老中医刘伟胜教授所创建的中药方剂，实验表明[7]，消积饮可通过阻滞肺癌细胞周期的G0/G1期起到抗癌作用。华蟾素是中药蟾蜍皮制剂的抗肿瘤中成药，能够有效地阻止肿瘤细胞周期于S期。针对三药对肺癌细胞周期不同阻滞点作用的机制，在本实验中，我们使用三药抑制小鼠Lewis肺癌的生长，观察三药抗小鼠肺癌细胞增殖的作用，并对三药作用于肿瘤细胞不同周期的协同抗癌机制进行了研究。
一.材料与方法
1.1 动物及瘤株
清洁级C57BL/6小鼠90只，体重18g～22g、雄性、6～8周龄，由第一军医大学动物中心提供；Lewis肺癌瘤株由广州中医药大学肿瘤研究所提供。
1.2 药物与仪器
1.2.1 环磷酰胺：上海华联制药有限公司，0.1g/瓶，白色结晶体，批准文号：沪卫药准字(1995)，第012034号。
1.2.2 消积饮口服液：广州中医药大学第二附属医院院内制剂，主要成分：黄芪、补骨脂、云芝、大黄、白花蛇舌草、莪术、全蝎、蜈蚣等，10ml/支，含1.5g生药/ml，批号：20030224。
1.2.3 华蟾素：淮北生化制药厂，5ml/支，生药2mg/ml，淡黄色澄明液体，批准文号：ZZ-5029-皖药准字(2001)第Z003299号。
1.2.4 长春瑞滨：连云港豪森制药有限公司，1ml/支，10mg/ml，无色澄明液体，批准文号：国药准字X19990278。
1.2.5 流式细胞仪：Coulter Co.Ltd. EPS型流式细胞仪
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及处理方法
全部实验采用无菌操作，取小鼠Lewis肺癌单细胞悬液，用生理盐水调制细胞悬液浓度至1×107/ml，每鼠右腋窝下接种0.2ml。接种次日将小鼠随机分成9组，按以下给药：NS阴性对照组：0.2 ml NS，I.P，qd×7d；CTX治疗组：CTX，30mg/kg体重，I.P，qd×7d；消积饮治疗组(XJY)：消积饮，0.2ml，P.O，qd×7d；华蟾素治疗组(HCS)：华蟾素，5ml/kg，I.P，qd×7d；长春瑞滨治疗组(NVB)：长春瑞滨，6.7mg/kg体重，I.P，qd×7d；其余四组XH、XN、HN与XHN组为相应的组合组，给予相应的联合药物。
1.3.2 计算瘤重及抑瘤率
停药次日使用颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离腋窝皮下肿瘤，去除血污、脂肪等，用电子天平称量体重及瘤重，根据以下公式计算抑瘤率：抑瘤率%＝(1-治疗组瘤重/阴性对照组瘤重)×100%。
1.3.3 细胞周期的观察
剥取部分新鲜肿瘤组织，PBS漂洗，浸泡，剪碎,混合，过滤，离心，再过滤，离心，75%的乙醇固定，Coulter-DNA-Prep Reagents Kit进行碘化丙啶(PI)染色，用EPS型流式细胞仪进行分析。
1.3.4 PCNA免疫组化
剥取部分新鲜肿瘤组织固定，脱水包埋，切片，脱腊后，梯度酒精水化，温浴，孵浴，DAB显色，脱水，封片。设PBS代替抗体作阴性对照及阳性对照片，显微镜下观察，细胞核呈棕黄色为阳性，每例随机观察几个视野(细胞总数大于2000)，计算PCNA阳性标记指数(PCNA-LI，%)，取平均值。
1.3.5 统计学分析
全部数据用均数±S表示，采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，各组小鼠之间瘤重、细胞周期各时相分布采用单因素方差分析。
二.结果
2.1各组小鼠肿瘤生长情况(见图1)及各组肿瘤瘤重及抑瘤率(见表1)
消积饮(XJY)、华蟾素(HCS)、长春瑞滨(NVB)、消积饮联合华蟾素(XH)、消积饮联合长春瑞滨(XN)、华蟾素联合长春瑞滨(HN)、三药联合治疗组(XHN)的平均瘤重与生理盐水组相比有显著性差异(p<0.01)；抑瘤率分别为32.28%、44.44%、48.68%、51.32%、57.14%、58.73%、64.55%。两药联合组的平均瘤重与单药相比具有差异(p<0.05)；三药联合组的平均瘤重与单药、两药相比具有差异(p<0.05)。
2.2 细胞周期的观察结果(见表2)
消积饮可阻滞肺癌细胞周期于G0/G1期，华蟾素阻滞肿瘤细胞周期于S期，长春瑞滨阻滞肿瘤细胞周期于G2/M期，分别与生理盐水组比较有显著性差异(p<0.01)；三药药联合组主要阻滞肺癌细胞周期于G0/G1期，与单药、两药相比具有统计学意义(p<0.05)。
2.3 XJY、HCS、NVB、XH、XN、HN、XHN各组对PCNA-LI的影响(见表3及图2)
图2可见高倍镜视野下PCNA染色阳性定位于细胞核，呈棕黄色，各治疗组增殖的小鼠Lewis肺癌细胞均少于生理盐水对照组，两药联合组少于相应单药组，三药联合组少于两药组。表3数据提示，各治疗组小鼠Lewis肺癌PCNA阳性标记指数均低于生理盐水组，具有统计学显著差异(p<0.01)；两药联合组PCNA阳性标记指数均低于相应单药组，三药联合组低于两药组，均具有统计学意义(p<0.05)。
三.讨论
非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的75%-80%，其中大部分在临床确诊时属于中晚期，70岁以上的患者约占1/3。对于ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者，以铂类为基础的联合化疗被认为是其标准治疗方案[1]，但铂类药物产生的肾毒性及多药联合化疗方案的骨髓造血毒性较大，尤其对于老年晚期非小细胞肺癌患者，难以耐受其毒副反应。近年来，针对老年非小细胞肺癌患者较差的耐受性，单药新药的化疗及中医药的治疗研究颇多，但其抗肿瘤机理仍需进一步探讨。
从细胞生物学来看，恶性肿瘤的本质在于细胞周期的调节失控，研究表明[2]：细胞周期失控是细胞增殖失控而导致癌变的重要原因，它使本来应脱离细胞周期而停止增殖或应自行凋亡的细胞不断进入细胞周期，从而出现无限制、自主的细胞增殖和分裂[3]。细胞周期是指处于增殖的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个连续过程。细胞周期按顺序划分为G1期-S期-G2期-M期四个阶段。细胞周期调控与细胞周期不同时相(G1、S、G2、M)间存在的关键调控点密切相关[4]。其中两个最为基本的调控点是G1/S调控点(位于G1期与S期的过渡时期，决定着是否进入细胞周期)和G2/M过渡点(位于G2期与M期之间，决定着细胞是立即进入M期完成有丝分裂或是停滞一段时间[5])。其中最重要的调控点是G1/S调控点，细胞在该点分析细胞内、外的各种复杂信号以及DNA损伤情况，以决定细胞是进入分裂程序、处于静止的G0期还是诱发细胞凋亡。肿瘤的发生多表现为细胞的异常增生与死亡减少，增殖细胞核抗原(PCNA)为DNA合成的辅助因子，作用于细胞的S期及与DNA修复相关的DNA合成过程中[6]，因此，PCNA可作为细胞增殖活性的一个重要指标。
抗肿瘤药物表现为阻抑肿瘤细胞异常增生或增加其死亡的作用。如果能够人为地施加某种干预因素，阻滞或延缓细胞周期中某一点或某一部分，从而导致细胞增殖的减慢或停止，达到杀灭肿瘤细胞的目的。因此，联合使用抗癌药物可对细胞周期中不同时相的细胞具有杀伤作用，使用原则为选择阻滞细胞周期不同时相的抗癌药物，以尽可能达到对细胞周期各时相都具有阻抑作用，最终达到最大限度的杀灭肿瘤细胞的目的。
长春瑞滨属于长春碱半合成衍生物，临床上是治疗老年晚期非小细胞肺癌疗效确切的单药化疗新药之一，其作用机制主要是通过微管蛋白的聚合，使细胞分裂停滞于细胞周期G2/M期。消积饮是广东省中医院的院内制剂，在治疗肺癌方面已取得显著的临床疗效，最近的实验研究提示，消积饮能够降低小鼠Lewis肺癌细胞cyclinD1的表达，影响其细胞周期G1/S调控点，有效地阻止肿瘤细胞周期于G0、G1期，使其不能进入S期进行DNA复制[7]。华蟾素也属于细胞周期特异性药物，主要作用于S期[8]。本实验中，根据三药对肿瘤细胞不同周期的阻滞作用，三药联合使用以期增强对肿瘤细胞的增殖起协同杀灭作用(见图3)。
本实验首先要进一步证实院内制剂消积饮的抗肿瘤作用，我们通过接种Lewis肺癌的小鼠模型，对消积饮的抑瘤作用进行了研究。结果提示，从肿瘤的生长以及皮下瘤重的减小均表明了消积饮对肿瘤有抑制作用。不同剂量消积饮对小鼠Lewis 肺癌均有抑瘤作用，不同剂量之间显示了一定的量效关系，即中高剂量组优于低剂量组。
实验结果提示消积饮、华蟾素及长春瑞滨三药单独使用均有抑瘤作用。运用流式细胞仪对细胞周期各时相分布的观察可见，与对照组相比，消积饮组的肿瘤细胞G0/G1期细胞比例增高，长春瑞滨组的肿瘤细胞G2/M期细胞比例增高，华蟾素的肿瘤细胞S期细胞比例增高。联合使用消积饮、华蟾素联合长春瑞滨治疗小鼠Lewis肺癌发现：消积饮合华蟾素、消积饮合长春瑞滨、华蟾素+长春瑞滨两药联合组分别阻滞细胞周期于G0/G1+S期、G0/G1+G2/M期、G2/M+S期，而三药联用主要阻滞细胞周期于G0/G1期。结果提示，三药联合组肿瘤细胞处于G0、G1期的比例高于其余各治疗组，具有统计学差异(p<0.05)，与生理盐水组相比有显著性差异(p<0.01)，说明该治疗方案能够更有效的影响细胞周期中的G1/S调控点，使肿瘤细胞停滞于G0、G1期，而不进入S期，进一步加强了抑瘤作用。各组PCNA阳性标记指数的结果提示，各治疗组PCNA-LI均低于生理盐水组，两药联合治疗组PCNA 阳性标记指数低于单药治疗组，三药联合低于单药及两药联合组，说明联合使用两药及三药可进一步抑制肺癌细胞增殖。以上结果提示：临床使用单药长春瑞滨治疗晚期肺癌的同时可加用中药消积饮及华蟾素，三药联合使用可望提高临床疗效，而本研究为临床上的进一步研究提供了实验依据。
表1各组小鼠肿瘤组织称重及抑瘤率(±S)
组别例数(只)瘤重(g)抑瘤率(%)NS阴性对照组101.89±0.39CTX阳性对照组100.66±0.43*65.08XJY治疗组101.28±0.43*32.28HCS治疗组101.05±0.49*44.44NVB治疗组100.97±0.28*48.68XJY+HCS治疗组100.92±0.28*▲51.32XJY+NVB治疗组100.81±0.47*▲57.14HCS+NVB治疗组100.78±0.43*▲58.73XJY+HCS+NVB治疗组100.67±0.32*★64.55注：*p<0.01 vs NS阴性对照组；▲p<0.05两药治疗组 vs相应单药治疗对照组；★p<0.05三药治疗组 vs两药治疗组。
表2XJY、HCS及NVB对小鼠Lewis肺癌细胞周期比例的影响(±S)
组别G0+G1期(%)S期(%)G2+M期(%)NS阴性对照组59.00±4.6720.20±0.9920.80±3.68CTX治疗对照组70.80±0.99*15.15±0.3514.05±0.64XJY治疗组66.65±1.06*15.05±0.5018.30±0.57HCS治疗组59.57±8.4626.30±3.40*14.13±7.16NVB治疗组52.60±4.3811.20±0.9926.20±5.33*XJY+HCS治疗组65.35±2.76*25.70±6.22*8.95±3.46XJY+NVB治疗组64.95±3.04*8.60±5.2327.45±3.60*HCS+NVB治疗组54.90±0.7122.60±3.6822.45±4.31XJY+HCS+NVB治疗组70.40±1.81*★12.07±3.397.47±4.39注： *p<0.01vs NS阴性对照组；★p<0.05三药治疗组 vs相应单药及两药治疗组。......（后略) ......
中药联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期及细胞增殖抗原的影响
广州中医药大学第二临床医学院肿瘤科吴万垠*柴小姝刘伟胜
摘要： 目的揭示中药消积饮、华蟾素联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期的作用机制。方法将90只皮下接种Lewis肺癌细胞的C57BL/6小鼠随机分成生理盐水阴性对照组(NS)、环磷酰胺治疗对照组(CTX)、消积饮组(XJY)、华蟾素组(HCS) 、长春瑞滨组(NVB)及其相应的组合(XH、XN、HN与XHN)，每组10只。给药7天后处死小鼠，比较各组小鼠的皮下瘤重，计算抑瘤率。运用FCM分析小鼠肿瘤细胞周期各时相分布的状况，并利用IHC计算PCNA阳性标记指数(PCNA-LI.%)。结果各治疗组瘤重较NS组低(p<0.01)，抑瘤率分别是32.28%、44.44%、48.68%、51.32%、57.14%、58.73%、64.55%。XJY组的G0/G1期肿瘤细胞较生理盐水组比例增高(p<0.01)，HCS组的肿瘤细胞阻滞于S期，较生理盐水组比例增高(p<0.01)，NVB组的肿瘤细胞G2/M期细胞较生理盐水组比例增高(p<0.01)；XJY+HCS的肿瘤细胞G0/G1期、S期细胞比例较NS组均有所增高(p<0.01)，XJY+NVB的肿瘤细胞G0/G1期、G2/M期细胞比例较NS组均有所增高(p<0.01)，HCS+NVB的肿瘤细胞S期、G2/M期细胞比例较NS组略高(p>0.05)；XJY+HCS+NVB的肿瘤细胞G0/G1期细胞比例较其余所有组增高(p<0.01)。XJY+HCS+NVB组的G0/G1期细胞与XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组比较，统计学分析具有差异(p<0.05)。XJY、HCS、NVB、XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB、XJY+HCS+NVB组的PCNA-LI均低于NS组(p<0.01)。XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组的PCNA-LI均低于XJY、HCS、NVB(p<0.01)。XJY+HCS+NVB组的PCNA-LI低于XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组(p<0.05)。结论消积饮、华蟾素和长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌具有协同抑制肺癌细胞增殖作用，两药联合作用优于单药，三药联合作用优于单药及两药作用。其作用机理可能与协同作用于不同细胞周期有关。
关键词：中药；长春瑞滨；Lewis肺癌；细胞周期；细胞增殖抗原
中药可对肺癌细胞周期中不同时相的细胞具有杀伤作用，阻滞或延缓细胞周期中某一点或某一部分，从而导致细胞增殖的减慢或停止，达到杀灭肺癌细胞的目的，联合使用抗癌药物的原则为选择阻滞细胞周期不同时相的抗癌药物，以尽可能达到对细胞周期各时相都具有阻抑作用，最终达到最大限度的杀灭肿瘤细胞。新药长春瑞滨属于细胞周期特异性药物，可作用于肿瘤细胞G2期而抑制肿瘤生长。消积饮口服液是广东省名老中医刘伟胜教授所创建的中药方剂，实验表明[7]，消积饮可通过阻滞肺癌细胞周期的G0/G1期起到抗癌作用。华蟾素是中药蟾蜍皮制剂的抗肿瘤中成药，能够有效地阻止肿瘤细胞周期于S期。针对三药对肺癌细胞周期不同阻滞点作用的机制，在本实验中，我们使用三药抑制小鼠Lewis肺癌的生长，观察三药抗小鼠肺癌细胞增殖的作用，并对三药作用于肿瘤细胞不同周期的协同抗癌机制进行了研究。
一.材料与方法
1.1 动物及瘤株
清洁级C57BL/6小鼠90只，体重18g～22g、雄性、6～8周龄，由第一军医大学动物中心提供；Lewis肺癌瘤株由广州中医药大学肿瘤研究所提供。
1.2 药物与仪器
1.2.1 环磷酰胺：上海华联制药有限公司，0.1g/瓶，白色结晶体，批准文号：沪卫药准字(1995)，第012034号。
1.2.2 消积饮口服液：广州中医药大学第二附属医院院内制剂，主要成分：黄芪、补骨脂、云芝、大黄、白花蛇舌草、莪术、全蝎、蜈蚣等，10ml/支，含1.5g生药/ml，批号：20030224。
1.2.3 华蟾素：淮北生化制药厂，5ml/支，生药2mg/ml，淡黄色澄明液体，批准文号：ZZ-5029-皖药准字(2001)第Z003299号。
1.2.4 长春瑞滨：连云港豪森制药有限公司，1ml/支，10mg/ml，无色澄明液体，批准文号：国药准字X19990278。
1.2.5 流式细胞仪：Coulter Co.Ltd. EPS型流式细胞仪
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及处理方法
全部实验采用无菌操作，取小鼠Lewis肺癌单细胞悬液，用生理盐水调制细胞悬液浓度至1×107/ml，每鼠右腋窝下接种0.2ml。接种次日将小鼠随机分成9组，按以下给药：NS阴性对照组：0.2 ml NS，I.P，qd×7d；CTX治疗组：CTX，30mg/kg体重，I.P，qd×7d；消积饮治疗组(XJY)：消积饮，0.2ml，P.O，qd×7d；华蟾素治疗组(HCS)：华蟾素，5ml/kg，I.P，qd×7d；长春瑞滨治疗组(NVB)：长春瑞滨，6.7mg/kg体重，I.P，qd×7d；其余四组XH、XN、HN与XHN组为相应的组合组，给予相应的联合药物。
1.3.2 计算瘤重及抑瘤率
停药次日使用颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离腋窝皮下肿瘤，去除血污、脂肪等，用电子天平称量体重及瘤重，根据以下公式计算抑瘤率：抑瘤率%＝(1-治疗组瘤重/阴性对照组瘤重)×100%。
1.3.3 细胞周期的观察
剥取部分新鲜肿瘤组织，PBS漂洗，浸泡，剪碎,混合，过滤，离心，再过滤，离心，75%的乙醇固定，Coulter-DNA-Prep Reagents Kit进行碘化丙啶(PI)染色，用EPS型流式细胞仪进行分析。
1.3.4 PCNA免疫组化
剥取部分新鲜肿瘤组织固定，脱水包埋，切片，脱腊后，梯度酒精水化，温浴，孵浴，DAB显色，脱水，封片。设PBS代替抗体作阴性对照及阳性对照片，显微镜下观察，细胞核呈棕黄色为阳性，每例随机观察几个视野(细胞总数大于2000)，计算PCNA阳性标记指数(PCNA-LI，%)，取平均值。
1.3.5 统计学分析
全部数据用均数±S表示，采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，各组小鼠之间瘤重、细胞周期各时相分布采用单因素方差分析。
二.结果
2.1各组小鼠肿瘤生长情况(见图1)及各组肿瘤瘤重及抑瘤率(见表1)
消积饮(XJY)、华蟾素(HCS)、长春瑞滨(NVB)、消积饮联合华蟾素(XH)、消积饮联合长春瑞滨(XN)、华蟾素联合长春瑞滨(HN)、三药联合治疗组(XHN)的平均瘤重与生理盐水组相比有显著性差异(p<0.01)；抑瘤率分别为32.28%、44.44%、48.68%、51.32%、57.14%、58.73%、64.55%。两药联合组的平均瘤重与单药相比具有差异(p<0.05)；三药联合组的平均瘤重与单药、两药相比具有差异(p<0.05)。
2.2 细胞周期的观察结果(见表2)
消积饮可阻滞肺癌细胞周期于G0/G1期，华蟾素阻滞肿瘤细胞周期于S期，长春瑞滨阻滞肿瘤细胞周期于G2/M期，分别与生理盐水组比较有显著性差异(p<0.01)；三药药联合组主要阻滞肺癌细胞周期于G0/G1期，与单药、两药相比具有统计学意义(p<0.05)。
2.3 XJY、HCS、NVB、XH、XN、HN、XHN各组对PCNA-LI的影响(见表3及图2)
图2可见高倍镜视野下PCNA染色阳性定位于细胞核，呈棕黄色，各治疗组增殖的小鼠Lewis肺癌细胞均少于生理盐水对照组，两药联合组少于相应单药组，三药联合组少于两药组。表3数据提示，各治疗组小鼠Lewis肺癌PCNA阳性标记指数均低于生理盐水组，具有统计学显著差异(p<0.01)；两药联合组PCNA阳性标记指数均低于相应单药组，三药联合组低于两药组，均具有统计学意义(p<0.05)。
三.讨论
非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的75%-80%，其中大部分在临床确诊时属于中晚期，70岁以上的患者约占1/3。对于ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者，以铂类为基础的联合化疗被认为是其标准治疗方案[1]，但铂类药物产生的肾毒性及多药联合化疗方案的骨髓造血毒性较大，尤其对于老年晚期非小细胞肺癌患者，难以耐受其毒副反应。近年来，针对老年非小细胞肺癌患者较差的耐受性，单药新药的化疗及中医药的治疗研究颇多，但其抗肿瘤机理仍需进一步探讨。
从细胞生物学来看，恶性肿瘤的本质在于细胞周期的调节失控，研究表明[2]：细胞周期失控是细胞增殖失控而导致癌变的重要原因，它使本来应脱离细胞周期而停止增殖或应自行凋亡的细胞不断进入细胞周期，从而出现无限制、自主的细胞增殖和分裂[3]。细胞周期是指处于增殖的细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个连续过程。细胞周期按顺序划分为G1期-S期-G2期-M期四个阶段。细胞周期调控与细胞周期不同时相(G1、S、G2、M)间存在的关键调控点密切相关[4]。其中两个最为基本的调控点是G1/S调控点(位于G1期与S期的过渡时期，决定着是否进入细胞周期)和G2/M过渡点(位于G2期与M期之间，决定着细胞是立即进入M期完成有丝分裂或是停滞一段时间[5])。其中最重要的调控点是G1/S调控点，细胞在该点分析细胞内、外的各种复杂信号以及DNA损伤情况，以决定细胞是进入分裂程序、处于静止的G0期还是诱发细胞凋亡。肿瘤的发生多表现为细胞的异常增生与死亡减少，增殖细胞核抗原(PCNA)为DNA合成的辅助因子，作用于细胞的S期及与DNA修复相关的DNA合成过程中[6]，因此，PCNA可作为细胞增殖活性的一个重要指标。
抗肿瘤药物表现为阻抑肿瘤细胞异常增生或增加其死亡的作用。如果能够人为地施加某种干预因素，阻滞或延缓细胞周期中某一点或某一部分，从而导致细胞增殖的减慢或停止，达到杀灭肿瘤细胞的目的。因此，联合使用抗癌药物可对细胞周期中不同时相的细胞具有杀伤作用，使用原则为选择阻滞细胞周期不同时相的抗癌药物，以尽可能达到对细胞周期各时相都具有阻抑作用，最终达到最大限度的杀灭肿瘤细胞的目的。
长春瑞滨属于长春碱半合成衍生物，临床上是治疗老年晚期非小细胞肺癌疗效确切的单药化疗新药之一，其作用机制主要是通过微管蛋白的聚合，使细胞分裂停滞于细胞周期G2/M期。消积饮是广东省中医院的院内制剂，在治疗肺癌方面已取得显著的临床疗效，最近的实验研究提示，消积饮能够降低小鼠Lewis肺癌细胞cyclinD1的表达，影响其细胞周期G1/S调控点，有效地阻止肿瘤细胞周期于G0、G1期，使其不能进入S期进行DNA复制[7]。华蟾素也属于细胞周期特异性药物，主要作用于S期[8]。本实验中，根据三药对肿瘤细胞不同周期的阻滞作用，三药联合使用以期增强对肿瘤细胞的增殖起协同杀灭作用(见图3)。
本实验首先要进一步证实院内制剂消积饮的抗肿瘤作用，我们通过接种Lewis肺癌的小鼠模型，对消积饮的抑瘤作用进行了研究。结果提示，从肿瘤的生长以及皮下瘤重的减小均表明了消积饮对肿瘤有抑制作用。不同剂量消积饮对小鼠Lewis 肺癌均有抑瘤作用，不同剂量之间显示了一定的量效关系，即中高剂量组优于低剂量组。
实验结果提示消积饮、华蟾素及长春瑞滨三药单独使用均有抑瘤作用。运用流式细胞仪对细胞周期各时相分布的观察可见，与对照组相比，消积饮组的肿瘤细胞G0/G1期细胞比例增高，长春瑞滨组的肿瘤细胞G2/M期细胞比例增高，华蟾素的肿瘤细胞S期细胞比例增高。联合使用消积饮、华蟾素联合长春瑞滨治疗小鼠Lewis肺癌发现：消积饮合华蟾素、消积饮合长春瑞滨、华蟾素+长春瑞滨两药联合组分别阻滞细胞周期于G0/G1+S期、G0/G1+G2/M期、G2/M+S期，而三药联用主要阻滞细胞周期于G0/G1期。结果提示，三药联合组肿瘤细胞处于G0、G1期的比例高于其余各治疗组，具有统计学差异(p<0.05)，与生理盐水组相比有显著性差异(p<0.01)，说明该治疗方案能够更有效的影响细胞周期中的G1/S调控点，使肿瘤细胞停滞于G0、G1期，而不进入S期，进一步加强了抑瘤作用。各组PCNA阳性标记指数的结果提示，各治疗组PCNA-LI均低于生理盐水组，两药联合治疗组PCNA 阳性标记指数低于单药治疗组，三药联合低于单药及两药联合组，说明联合使用两药及三药可进一步抑制肺癌细胞增殖。以上结果提示：临床使用单药长春瑞滨治疗晚期肺癌的同时可加用中药消积饮及华蟾素，三药联合使用可望提高临床疗效，而本研究为临床上的进一步研究提供了实验依据。
表1各组小鼠肿瘤组织称重及抑瘤率(±S)
组别例数(只)瘤重(g)抑瘤率(%)NS阴性对照组101.89±0.39CTX阳性对照组100.66±0.43*65.08XJY治疗组101.28±0.43*32.28HCS治疗组101.05±0.49*44.44NVB治疗组100.97±0.28*48.68XJY+HCS治疗组100.92±0.28*▲51.32XJY+NVB治疗组100.81±0.47*▲57.14HCS+NVB治疗组100.78±0.43*▲58.73XJY+HCS+NVB治疗组100.67±0.32*★64.55注：*p<0.01 vs NS阴性对照组；▲p<0.05两药治疗组 vs相应单药治疗对照组；★p<0.05三药治疗组 vs两药治疗组。
表2XJY、HCS及NVB对小鼠Lewis肺癌细胞周期比例的影响(±S)
组别G0+G1期(%)S期(%)G2+M期(%)NS阴性对照组59.00±4.6720.20±0.9920.80±3.68CTX治疗对照组70.80±0.99*15.15±0.3514.05±0.64XJY治疗组66.65±1.06*15.05±0.5018.30±0.57HCS治疗组59.57±8.4626.30±3.40*14.13±7.16NVB治疗组52.60±4.3811.20±0.9926.20±5.33*XJY+HCS治疗组65.35±2.76*25.70±6.22*8.95±3.46XJY+NVB治疗组64.95±3.04*8.60±5.2327.45±3.60*HCS+NVB治疗组54.90±0.7122.60±3.6822.45±4.31XJY+HCS+NVB治疗组70.40±1.81*★12.07±3.397.47±4.39注： *p<0.01vs NS阴性对照组；★p<0.05三药治疗组 vs相应单药及两药治疗组。......（后略) ......
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