自体骨髓单个核细胞移植治疗重症下肢缺血25例报道
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自体骨髓单个核细胞移植治疗重症下肢缺血25例报道*
北京中医药大学附属东直门医院血管外科
杨博华秦建辉朱龄群陈蕾路红李友山周笑允吴鲁辉庞鹤
摘要：目的 研究自体骨髓单个核细胞移植对下肢缺血的治疗作用。方法 治疗对象为25例严重下肢缺血患者。术前用集落细胞刺激因子使患者骨髓处于增生活跃状态，抽取骨髓液后分离单个核细胞，细胞总量达到1×109以上。移植采用缺血肢体多点注射。观察患者手术前后肢体疼痛评分、冷感评分、踝肱比(ABI)以及溃疡创面情况，评价治疗效果。结果 治疗后一周患者肢体疼痛评分及冷感评分明显下降，两周时又有回升，术后一月时再度下降。ABI在术后逐渐升高，术后一月平均升高0.125。结论 自体骨髓单个核细胞移植可以改善下肢缺血患者下肢缺血的临床症状及体征。
关键词：骨髓移植；单个核细胞；下肢缺血
近年来，动脉硬化及糖尿病引起的下肢慢性缺血的患者越来越多。治疗方法虽然很多，但疗效尚难尽人意，尤其对于肢体远端动脉闭塞患者缺乏有效的治疗措施。我们采用自体骨髓单个核细胞移植(Autologous Bone-Marrow Mononuclear Cells Transplantation，ABMCT)治疗下肢缺血，取得了初步疗效，现将结果报告如下。
本临床研究经东直门医院伦理委员会评审批准。
一.材料与方法
1.1 治疗对象
治疗对象为无法行外科手术或介入治疗的下肢缺血性病变患者，同时对药物治疗(经1个月系统中西药物治疗)疗效不佳者。病例排除标准：五年之内患过恶性肿瘤或有严重糖尿病性眼底血管病变的患者不能接受此治疗。
共25名患者，男12例，女13例，年龄42岁到85岁，平均73.7岁。均有静息痛，疼痛评分均在3分以上，平均3.7分；均有患肢冷感，冷感评分均在3分以上；ABI:，0-0.58，平均0.37；除3例患者外均有肢体溃疡或坏死。
1.2 方法
1.2.1 自体骨髓单个核细胞采集及处理：基础加局部麻醉后在病人髂后上棘处抽取骨髓液约150～200ml，并将其置于肝素化1640液中。用Ficcol液密度梯度离心法分离骨髓液中的单个核细胞。单个核细胞总量要达到1×109以上，根据移植点数将细胞悬液总容量稀释到20ml-30ml。
1.2.2 自体骨髓单个核细胞移植：在基础麻醉下，消毒患肢皮肤，用23G注射器行局部注射，每点注射单个核细胞悬液0.3~0.5ml，每点间隔3cm。如果有局部溃疡或坏死，则同时在溃疡或坏死周边组织进行点状注射。
1.2.3 疗效评定：分别于术后1周、2周、1个月对疼痛、冷感、ABI及创面情况进行评价。
1.2.3.1 疼痛评分标准：0分：无疼痛；1分：偶有疼痛，被问时能回忆起；2分：经常出现疼痛但能耐受，不需或偶需用一般止痛剂；3分：经常用 一般止痛剂；4分：因疼痛影响睡眠，一般止痛剂难以缓解。
1.2.3.2 冷感评分标准：0分：无冷感；1分：患者偶诉受累肢体有发凉、怕冷的感觉；2分：受累肢体经常有发凉、怕冷的感觉；3分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，须采用局部保温措施，症状能得到一定程度的缓解；4分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，采用局部保温措施，症状亦无明显改善。
二.结果
2.1 治疗前后患肢疼痛的变化(见图1)
图1疼痛评分术前术后对比
图1显示患肢痛感于治疗后一周明显减轻，在两周时又有加重，治疗后一月时痛感明显减轻。因方差检验示方差不齐，不能进行均数梯度差别显著性检验。
2.2 治疗前后患肢冷感变化(见图2)
图2冷感评分术前术后对比
图2显示患者肢体冷感于治疗后一周明显减轻，治疗后两周又有加重，治疗后一月肢体冷感基本缓解。因为方差检验示方差不齐，无法进行均数梯度的差异显著性检验。
2.3 踝肱指数(ABI)测定结果(见图3)
图3显示治疗后ABI缓慢增加，至治疗后一月时平均增加0.125。因为有临床改善，按TASC缺血肢体评价标准，可以判断肢体缺血程度有改善。
图3ABI术前术后对比
2.4 创面改善情况
4例足部坏疽患者ABMT治疗后创面无明显改变，治疗后一月时行截趾术，术后2周创面一期愈合。5例伴足部溃疡患者溃疡面积在术后一月时均缩小，但未完全愈合。
2.5 副作用
所有接受ABMT患者在随访时均未发现副作用
三.讨论
骨髓单个核细胞主要包括骨髓间充质干细胞和造血干细胞，现在已证实来源于骨髓CD34+细胞的某一亚群在体外能分化形成血管内皮细胞，在体内则能被诱导形成小血管的内表面[1]。血管内皮细胞的增殖、分化、迁移而诱导毛细血管生成[2]。而且骨髓干细胞还能分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和IL-1β等细胞因子，可以促进内皮细胞的增生及血管生成。自从Eriko TY[3]在2002年The Lancet报道用ABMCT治疗下肢缺血患者45例取得良好临床效果后，血管生成已经发展成为一种治疗缺血性疾病的新方法。
我们的临床观察发现，ABMCT治疗后一个月病人的静息痛均有明显减轻，并随着时间的延长逐渐缓解。其次是ABI的改变，25例病人ABI均有不同程度的提高，1月后ABI平均提高了0.125。ABI是反映缺血肢体血供情况较常用的客观指标之一，从治疗后一周起ABI既有上升，1月后有了较为稳定的增加。按TASC关于肢体缺血严重程度的评价方法，有临床缺血症状改善时ABI上升0.125，可以判断缺血情况得到了改善。
自体骨髓单个核细胞悬液在缺血局部注射后可能因组织反应造成充血及无菌性炎症，导致治疗后早期的肢体疼痛及冷感减轻。新生血管形成可能在治疗后四周开始。
目前我们仅对25例病人进行了临床观察，所以对所有患者在进行ABMCT治疗的同时还同时给予药物辅助治疗，包括扩血管及抗血小板等治疗，以期得到最好的临床效果。所以我们很难通过此临床观察得出明确的结论。但综合本观察结果，我们可以提出以下几个初步判断：
(1)自体骨髓单个核细胞获得容易、对患者打击小，高龄、一般情况较差的患者也可耐受操作。
(2)ABMCT操作简单、创伤小，高龄、一般情况较差的患者也能耐受。
(3)ABMCT后细胞的分化转轨目前还不十分清楚，需要行动物试验或人体细胞标记证实。
(4)ABMCT对患者可能是安全的。
(5)ABMCT是治疗重症下肢缺血的很有前景的方法。
参考文献：
1. Shintani S, Murohara T, Ikeda HM, et al.Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation. Circulation, 2001, 13(2): 897-903.
2. Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T, et al. Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines. Circulation, 2001, 104: 1046-1052.
3. Eriko TY, Hiroaki M, Toyoaki M, et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial. The Lancet, 2002, 360: 427-435.
(责任编辑：肖雁凌、胡廉、赵洋、赵颖琦)
*北京中医药大学附属东直门医院血管外科是北京市重点学科，是集医、教、研于一体的骨干临床科室。主任杨博华是全国著名的周围血管科专家。科室人才结构合理，形成了以庞鹤教授为学科带头人，杨博华教授为科主任，秦建辉博士等出国留学人员组成的一支人员结构合理、具有较高医疗水平和科研能力的医教研队伍。通讯地址：北京中医药大学附属东直门医院血管外科，邮编：100700；电话：010-84013356, 010-84013155/6; E-mail: doctorqinjian@yahoo.com.cn, doctorliyou@yahoo.com.cn.
自体骨髓单个核细胞移植治疗重症下肢缺血25例报道*
北京中医药大学附属东直门医院血管外科
杨博华秦建辉朱龄群陈蕾路红李友山周笑允吴鲁辉庞鹤
摘要：目的 研究自体骨髓单个核细胞移植对下肢缺血的治疗作用。方法 治疗对象为25例严重下肢缺血患者。术前用集落细胞刺激因子使患者骨髓处于增生活跃状态，抽取骨髓液后分离单个核细胞，细胞总量达到1×109以上。移植采用缺血肢体多点注射。观察患者手术前后肢体疼痛评分、冷感评分、踝肱比(ABI)以及溃疡创面情况，评价治疗效果。结果 治疗后一周患者肢体疼痛评分及冷感评分明显下降，两周时又有回升，术后一月时再度下降。ABI在术后逐渐升高，术后一月平均升高0.125。结论 自体骨髓单个核细胞移植可以改善下肢缺血患者下肢缺血的临床症状及体征。
关键词：骨髓移植；单个核细胞；下肢缺血
近年来，动脉硬化及糖尿病引起的下肢慢性缺血的患者越来越多。治疗方法虽然很多，但疗效尚难尽人意，尤其对于肢体远端动脉闭塞患者缺乏有效的治疗措施。我们采用自体骨髓单个核细胞移植(Autologous Bone-Marrow Mononuclear Cells Transplantation，ABMCT)治疗下肢缺血，取得了初步疗效，现将结果报告如下。
本临床研究经东直门医院伦理委员会评审批准。
一.材料与方法
1.1 治疗对象
治疗对象为无法行外科手术或介入治疗的下肢缺血性病变患者，同时对药物治疗(经1个月系统中西药物治疗)疗效不佳者。病例排除标准：五年之内患过恶性肿瘤或有严重糖尿病性眼底血管病变的患者不能接受此治疗。
共25名患者，男12例，女13例，年龄42岁到85岁，平均73.7岁。均有静息痛，疼痛评分均在3分以上，平均3.7分；均有患肢冷感，冷感评分均在3分以上；ABI:，0-0.58，平均0.37；除3例患者外均有肢体溃疡或坏死。
1.2 方法
1.2.1 自体骨髓单个核细胞采集及处理：基础加局部麻醉后在病人髂后上棘处抽取骨髓液约150～200ml，并将其置于肝素化1640液中。用Ficcol液密度梯度离心法分离骨髓液中的单个核细胞。单个核细胞总量要达到1×109以上，根据移植点数将细胞悬液总容量稀释到20ml-30ml。
1.2.2 自体骨髓单个核细胞移植：在基础麻醉下，消毒患肢皮肤，用23G注射器行局部注射，每点注射单个核细胞悬液0.3~0.5ml，每点间隔3cm。如果有局部溃疡或坏死，则同时在溃疡或坏死周边组织进行点状注射。
1.2.3 疗效评定：分别于术后1周、2周、1个月对疼痛、冷感、ABI及创面情况进行评价。
1.2.3.1 疼痛评分标准：0分：无疼痛；1分：偶有疼痛，被问时能回忆起；2分：经常出现疼痛但能耐受，不需或偶需用一般止痛剂；3分：经常用 一般止痛剂；4分：因疼痛影响睡眠，一般止痛剂难以缓解。
1.2.3.2 冷感评分标准：0分：无冷感；1分：患者偶诉受累肢体有发凉、怕冷的感觉；2分：受累肢体经常有发凉、怕冷的感觉；3分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，须采用局部保温措施，症状能得到一定程度的缓解；4分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，采用局部保温措施，症状亦无明显改善。
二.结果
2.1 治疗前后患肢疼痛的变化(见图1)
图1疼痛评分术前术后对比
图1显示患肢痛感于治疗后一周明显减轻，在两周时又有加重，治疗后一月时痛感明显减轻。因方差检验示方差不齐，不能进行均数梯度差别显著性检验。
2.2 治疗前后患肢冷感变化(见图2)
图2冷感评分术前术后对比
图2显示患者肢体冷感于治疗后一周明显减轻，治疗后两周又有加重，治疗后一月肢体冷感基本缓解。因为方差检验示方差不齐，无法进行均数梯度的差异显著性检验。
2.3 踝肱指数(ABI)测定结果(见图3)
图3显示治疗后ABI缓慢增加，至治疗后一月时平均增加0.125。因为有临床改善，按TASC缺血肢体评价标准，可以判断肢体缺血程度有改善。
图3ABI术前术后对比
2.4 创面改善情况
4例足部坏疽患者ABMT治疗后创面无明显改变，治疗后一月时行截趾术，术后2周创面一期愈合。5例伴足部溃疡患者溃疡面积在术后一月时均缩小，但未完全愈合。
2.5 副作用
所有接受ABMT患者在随访时均未发现副作用
三.讨论
骨髓单个核细胞主要包括骨髓间充质干细胞和造血干细胞，现在已证实来源于骨髓CD34+细胞的某一亚群在体外能分化形成血管内皮细胞，在体内则能被诱导形成小血管的内表面[1]。血管内皮细胞的增殖、分化、迁移而诱导毛细血管生成[2]。而且骨髓干细胞还能分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和IL-1β等细胞因子，可以促进内皮细胞的增生及血管生成。自从Eriko TY[3]在2002年The Lancet报道用ABMCT治疗下肢缺血患者45例取得良好临床效果后，血管生成已经发展成为一种治疗缺血性疾病的新方法。
我们的临床观察发现，ABMCT治疗后一个月病人的静息痛均有明显减轻，并随着时间的延长逐渐缓解。其次是ABI的改变，25例病人ABI均有不同程度的提高，1月后ABI平均提高了0.125。ABI是反映缺血肢体血供情况较常用的客观指标之一，从治疗后一周起ABI既有上升，1月后有了较为稳定的增加。按TASC关于肢体缺血严重程度的评价方法，有临床缺血症状改善时ABI上升0.125，可以判断缺血情况得到了改善。
自体骨髓单个核细胞悬液在缺血局部注射后可能因组织反应造成充血及无菌性炎症，导致治疗后早期的肢体疼痛及冷感减轻。新生血管形成可能在治疗后四周开始。
目前我们仅对25例病人进行了临床观察，所以对所有患者在进行ABMCT治疗的同时还同时给予药物辅助治疗，包括扩血管及抗血小板等治疗，以期得到最好的临床效果。所以我们很难通过此临床观察得出明确的结论。但综合本观察结果，我们可以提出以下几个初步判断：
(1)自体骨髓单个核细胞获得容易、对患者打击小，高龄、一般情况较差的患者也可耐受操作。
(2)ABMCT操作简单、创伤小，高龄、一般情况较差的患者也能耐受。
(3)ABMCT后细胞的分化转轨目前还不十分清楚，需要行动物试验或人体细胞标记证实。
(4)ABMCT对患者可能是安全的。
(5)ABMCT是治疗重症下肢缺血的很有前景的方法。
参考文献：
1. Shintani S, Murohara T, Ikeda HM, et al.Augmentation of postnatal neovascularization with autologous bone marrow transplantation. Circulation, 2001, 13(2): 897-903.
2. Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T, et al. Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines. Circulation, 2001, 104: 1046-1052.
3. Eriko TY, Hiroaki M, Toyoaki M, et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial. The Lancet, 2002, 360: 427-435.
(责任编辑：肖雁凌、胡廉、赵洋、赵颖琦)
*北京中医药大学附属东直门医院血管外科是北京市重点学科，是集医、教、研于一体的骨干临床科室。主任杨博华是全国著名的周围血管科专家。科室人才结构合理，形成了以庞鹤教授为学科带头人，杨博华教授为科主任，秦建辉博士等出国留学人员组成的一支人员结构合理、具有较高医疗水平和科研能力的医教研队伍。通讯地址：北京中医药大学附属东直门医院血管外科，邮编：100700；电话：010-84013356, 010-84013155/6; E-mail: doctorqinjian@yahoo.com.cn, doctorliyou@yahoo.com.cn.
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